LAPORAN PRAKTIKUM PEMBUATAN PREPARAT IRISAN METODE PARAFIN

255 views

LAPORAN
RESMI
PRAKTIKUM
EMBRIOLOGI HEWAN
I.                  
JUDUL : Pembuatan Preparat Irisan Metode
Parafin
II.               
TUJUAN
Membuat
preparat irisan melalui penyelubungan dengan metode parafin menggunakan
pewarnaan hematoxylin eosin
III.            
DASAR TEORI
Metode paraffin termasuk metode sayatan
yang banyak digunakan, karena hampir semua jaringan dapat dipotong dengan
metode ini. Pengamatan secara mikroskopis dari suatu jaringan dalam berbagai
kondisi dan berbagai elemen jaringan dapat diamati atau diteliti melalui
preparat permanen yang dibuat dengan metode paraffin. Pembuatan preparat dengan
metode paraffin adalah metode yang paling umum digunakan untuk pembuatan
preparat permanent, baik pada tumbuhan ataupun pada hewan (Anonim, 2011).
Metode parafin adalah suatu metode
pembuatan preparat dengan melakukan penanaman jaringan di dalam blok parafin
untuk menghasilkan preparat jaringan hewan ataupun tumbuhan yang tipis.
Preparat parafin ini dilakukan penyelubungan karena jaringan merupakan
bahan yang lunak. Pembuatan sediaan dengan pemotongan jaringan menggunakan
parafin dan mikrotom sebagai alat pemotongnya. Dilakukan infiltrasi agar
parafin yang masuk berfungsi sebagai penyangga jaringan saat diiris dengan
mikrotom, lalu diembedding (proses penanaman) yaitu merendam jaringan ke
dalam parafin cair, dan parafin akan masuk ke seluruh bagian jaringan,
proses pemotongan dengan mikrotom, penempelan pada kaca objek, pewarnaan
dengan haematoksilin (pada umumnya bahan ini yang sering digunakan untuk
jaringan hewan) sedangkan jaringan tumbuhan seringkali menggunakan
safranin ataupun fast green. Setelah diwarnai lalu dimounting, diberi
perekat entellan, dan diberi label nama (Tjiptrosoepomo, 1993).
Prosedur pembuatan sediaan menggunakan
metode parafin pada umumnya sama baik pada jaringan hewan maupun tumbuhan.
Pertama–tama organ yang akan dijadikan preparat diisolasi terlebih dahulu,
kemudian difiksasi minimal 24 jam, didehidrasi dengan alkohol bertingkat
selama 30 menit, diclearing dengan xilol murni juga selama 30 menit,
diinfiltrasi agar parafin yang masuk berfungsi sebagai
penyangga jaringan saat diiris dengan mikrotom, lalu
diembedding (proses penanaman) yaitu merendam jaringan ke dalam parafin
cair, dan parafin akan masuk ke seluruh bagian jaringan, proses pemotongan
dengan mikrotom, penempelan pada kaca objek, pewarnaan dengan
haematoksilin (pada umumnya bahan ini yang sering digunakan untuk jaringan
hewan) sedangkan jaringan tumbuhan seringkali menggunakan safranin ataupun
fast green. Setelah diwarnailalu dimounting, diberi perekat entellan, dan diberi
label nama (Santoso, 2002).
Pada organ hewan, Embedding merupakan
proses pelilinan suatu organ dengan menggunakan kotak kertas. Proses ini
memudahkan dalam membuat irisan yang sangat tipis dengan menggunakan mikrotom.
Beberapa keuntungan menggunakan kotak kertas dalam embedding yaitu bisa membuat
arah sayatan dan menandai suatu jaringan. Jaringan atau sampel akan ditanam di
ketas kotak, dengan terlebih dahulu parafin membeku pada bagian dasar dalam
kotak dan setelah penempelan jaringan dilanjutkan dengan penutupan dengan
parafin sampai membeku.
Proses penyayatan (sectioning) diawali
dengan pengirisan blok parafin dengan scalpel, sehingga permukaan blok parafin
yang akan diiris dengan mikrotom berbentuk segi empat. Letak mata pisau pada
mikrotom menentukan hasil yang diperoleh. Hasil sayatan diambil dengan
menggunakan kuas secara hati-hati. Pita hasil sayatan ditempel pada kaca objek
dengan menggunakan meyer albumin. Kaca obyek tersebut diletakkan di atas meja
penangas ( haeting plate). Meyer albumin memiliki kandungan putih telur dan
gliserin dan merupakan pelakat alami yang sangat baik (Hugo 2008).Proses
pewarnaan dilakukan setelah preparat dideparafinasi dengan merendam preparat
pada xylol. Salah satu pewarna metode parafin pada jaringan hewan adalah hematoxylin
dan Eosin. Zat warna hematoxilin ini bersifat aquaosa.
Ada beberapa macam paraffin yaitu
paraffin lunak dengan titik leleh 48oC, paraffin medium dengan titik leleh
52oC, dan paraffin keras dengan titik leleh 56oC. Waktu yang dibutuhkan di
setiap tahapan paraffin yaitu 15-20 menit. Tidak perlu waktu yang cukup lama
karena dilakukan di dalam oven yang menyebabkan jaringan kuat dan rapuh
(Botanika, 2008).
Embedding dilakukan dengn membuat kotak
kertas. Beberapa keuntungan menggunakan kotak kertas yaitu bisa membuat arah
sayatan dan menandai jaringan. Sebelum jaringan atau sampel ditanam maka
terlebih dahulu paraffin dalam kotak harus membeku pada bagian dasarnya
sehingga memungkinkan objek tidak langsung menempel pada dasar kertas. Blok
paraffin yang akan disayat dulu maka dibentuk dulu (trimming). Bentuk blok
disesuaikan dengan bentuk pitanya yang diinginkan. Hal in dikarenakan penampang
blok paraffin menggambarkan blok pita yangg akan diiris.Letak mata pisau pada
mikrotom sangat menentukan hasil yang diperoleh. Pisau dibersihan dengan xylol
dari sisa-sisa paraffin yang menempel. Hasil sayatan diambill dengan
menggunakan kuas secara hati-hati. Hasil sayatan diletakkan dalam bak khhusuus
dann diperhatikan urutannya. Pita hasil sayatan ditempel pada kaca objek dengan
menggunakan meyer albumin. Kaca objek selanjutnya diletakkan di atas meja
penangans (heating plate) (Botanika, 2008). Meyer albumin memiliki kandungan
putih telur dan gliserin dan merupakan pelekat alami yang sangat baik (Hugo,
2008).
Sangatlah penting dilakukan rehidrasi
atau dehidrasi sebelum dilakukan pewarnaan. Hal itu baru dilakukan bila
paraffin dalam sayatan sudah larut dan biasanya dilarutkan dalam xylol
(Botanika, 2008).
Proses sectioning diawali dengan
pengirisan blok parafin dengan scalpel, sehingga permukaan blok parafin yang
akan diiris dengan mikrotom berbentuk segi empat. Irislah sedemikian rupa,
sehingga preparat akan terletak tepat berada di tengah blok. Proses pewarnaan
dilakukan setelah preparat dideparafinasindengan merendam preparat pada xylol.
Salah satu pewarna metode parafin pada jaringan hewan adalah hematoxylin dan
Eosin. Zat warna hematoxilin ini bersifat aquaosa
Mikrotom ada beberapa macam yaitu :
1.     
Mikrotom geser (sliding mikrotome). Pada
alat ini, jaringan tetap berada pada tempatnya, sedang pisaunya yang bergerak.
Pada umumnya jaringan yang akan dipotong dengan mikrotom geser adalah jaringan
yang tanpa penanaman (embedding) terlebih dulu. Disini tidak akan terjadi pita
irisan. Jaringan yang akan diiris sebelumnya dapat diwarnai dengan pewarnaan
tunggal, ataupun tanpa pewarnaan terlebih dahulu. Metode ini banyak dikerjakan
untuk pengirisan jaringan tumbuh-tumbuhan.
2.     
Mikrotom beku (freezing microtome). Alat
ini dihubungkan dengan tabung berisi CO2 dingin, melalui suatu pipa karet.
Mikrotom ini, keadaannya sama dengan mikrotom geser yaitu jaringan tetap berada
pada tempatnya sedang pisau mikrotomnya yang bergerak ke muka dan ke belakang.
3.     
Mikrotom putar (rotary microtome).
Berbeda dengan 2 jenis mikrotom diatas, yaitu bahwa pada mikrotom ini, pisau
tetap pada tempatnya sedang jaringannya yang bergerak ke atas dan ke
bawah. Jenis mikrotom ini yang biasanya digunakan untuk pembuatan
sediaan irisan dengan metode parafin (Rina, 2010).
IV.            
ALAT DAN BAHAN
a.     
Alat
1.        
Papan paraffin                         1 buah
2.        
Pisau bedah                             1
buah
3.        
Jarum pentul                            secukupnya
4.        
Gunting bedah                         1 buah
5.        
Cawan petri                             1
buah
6.        
Pinset                                       1 buah
7.        
Gelas bekker                            1 buah
8.        
Objek glass                              9 buah
9.        
Deg glass                                 9 buah
10.    
Kuas                                        1
buah
11.    
Staining jar                              1 buah
12.    
Tabung untuk fiksasi   1 buah
13.    
Gelas-gelas petri                      secukupnya
14.    
Mikrotom                                 1
buah
15.    
Hot plate                                  1 buah
16.    
Mikroskop                               1 buah
b.     
Bahan
1.     
Lambung katak (Rana sp)       1 buah
2.     
Alcohol 70%, 80%, 90%, 96%, absolute
(100%)        secukupnya
3.     
Larutan xylol                           secukupnya
4.     
Paraffin                                    secukupnya
5.     
Larutan Bouine                        secukupnya
6.     
Larutan hematocilin                 secukupnya
7.     
Eosin                                        secukupnya
8.     
Larutan Entellan                      secukupnya
9.     
Aquades                                  secukupnya
10.  Meyer
albumin                         secukupnya
11.  Larutan ringer                         secukupnya
V.               
CARA KERJA
1.     
Narcose (pembiusan), kapas dibasahi
dengan eter kemudian ditempelkan pada nares anterior katak
2.     
Section (pemotongan) dilakukan section
dengan hati-hati hingga diperoleh potongan organ yang akan diawetkan sebesar
3-5 mm, kemudian darah atau kotoran yang menempel dibersihkan dengan garam
fisiologis
3.     
Labeling (pelabelan), dibuat label yang
sesuai dan ditempelkan pada potongan jaringan (ditempel di luar botol). Organ
dimasukkan ke dalam larutan fiksatif
4.     
Fiksasi, potongan jaringan yang telah
belabel dimasukkan dalam botol-botol flakon yang sudah berisi larutan fiksatif
selama 24jam
5.     
Washing (pencucian), potongan jaringan
yang telah terfiksasi dicuci langsung degan alcohol 70% yang sekaligus untuk
mengusir piktatnya hingga warna kuning hilang. Alcohol 70% di sini sebagai
stopping point
6.     
Dehidrasi, organ-organ tersebut dicuci
dengan alcohol bertingkat, yaiut 80%, 90%, 96% dan alcohol absolute secara
bergantian dengan cara 2×30 menit untuk masing-masing alcohol
7.     
Clearing (penjernihan), potongan
jaringan atau norgan dipindahkan ke dalam botol yang berisi toluol selama
semalam hingga didapatkan organ tersebut menjadi transparan
8.     
Infiltrasi, dilakukan di dalam oven atau
incubator dengan temperature 55-60°C organ dilarutkan ke dalam larutan xylol +
paraffin dengan perbandingan 1:1 yang dimasukkan dalam gela beker. Kemudian
pada deretan paraffin murni I, II, III. Potongan organ berturut-turut
dipindahkan ke dalm gelas-gelas bekker tersebut masing-masing 1jam
9.     
Embedding (penyelubungan), disiapkan
temapat paraffin yang akan digunakan untuk menahan potongan jaringan dari
karton atau kertas kalender yang dibuat kotak-kotak sebesar 2x2x2 cm. masukkan
paraffin ke dalam kotak-kotak tersebut hingga penuh. Kemudian potongan jaringan
segera dipindahkan ke dalam paraffin cair tersebut, diatur letaknya menurut
rencana pemotongan, akan diiris melintang atau membujur
10.  Sectioning
(pengirisan), blok-blok paraffin dikeluarkan dari cetakannya kemudian dibentuk
dengan cara mengiris dengan scalpel sedemikian rupa sehingga permukaan yang
akan diiris dengan pisau mikrotom berbentuk segiempat teratur, semua sisinya
sejajar. Blok paraffin diletakkan pada holder kayu sehingga melekat erat,
caranya dengan mencairkan sedikit paraffin kemudian ditaru pada holder dan blok
paraffin diletakkan padanya hingga tidak goyah lagi. Kemudian holder bersama
blok paraffin diparang pada rotary mikrotom dan dimantapkan. Diiris dengan
rotary mikrotom dengan ketebalan 5 mikron. Disiapkan kertas putih untuk kertas
pita preparat serta kuas untuk mengambil coopes dari pisau mikrotom pada
tempatnya di mikrotom
11.  Affixing,
obyek glass ditetesi dengan albumen mayer selanjutnya ditetesi dengan aquades
secukupnya, coopes yang terpilih diletakkan di atas obyek glass tersebut dan
direntangkan. Kemudian obyek glass tersebut diletakkan di atas hot plates yang
bersuhu 40-45°C diatur letak coupesnya, rentangkan apabila terlipat, akuades
yang berlebih dihisap dengan pipet atau kertas penghisap dibiarkan hingga
kering
12.  Staining
(pewarnaan)
a.      
Disiapkan larutan alcohol bertingkat,
akuades, larutan pewarna hematicilin, dan eosin masing-masing dalam straining
jaringan disusun sesuai urutan prosesinya, satinning jaringan harus segera
tertutup setelah digunakan karena alcohol atau xylol mudah menguap
b.     
Deparafinisasi dengan xylolminimal
15menit (sampai paraffin larut), coupes harus terendam oleh xylol
c.      
Dilap dengan kertas hisap
d.     
Dimasukkan alcohol bertingkat 96% sampai
dengan alcohol 30% dan akuades masing-masing 1 celupan
e.      
Diwarnai dengan hemaktosilin 3-7 detik,
dibersihkan dengan cara dicelup-celup secara hati-hati di akuades atau air
biasa
f.      
Dicuci dengan air mengalir selama 3
menit
g.     
Dimasukkan ke dalam alcohol bertingkat
30%-70% masing-masing 1 celupan
h.     
Diwarnai dengan eosin 15-30%
i.       
Dicuci dengan alcohol 70% bilas sampai
obyek glass bersih atau tidak merah
j.       
Dimasukkan lagi ke alcohol 70%-96%
masing-masing 1 kali celupan
k.     
Ditetesi dengan alcohol absolute
l.       
Dilap dengan kertas hisap
m.   
Dimasukkan ke dalam xylol selama 15
menit
n.     
Dilap dengan kertas denga kertas hisap
13.  Mounting
(penutupan)
a.      
Canada balsam diteteskan di atas coupes
ditutup dengan kertas penutup
b.     
Diletakkan di atas hot plate agar cepat
kering
c.      
Dilakukan pemerikasaan di bawah
mikroskop untuk melihat afinitas jaringan terhadap zat warna bila hasil
pewarnaan jelek tidak perlu di tutup dengan Canada balsam dfan deg glass
14.  Labeling,
ditulis data lengkap dengan preparat yang telah dibuat pada label yang kemudian
ditempel pada salah satu sisi obyek glass
15.  Preparat
yang telah berhasil dibuat digambar secara lengkap dan dibuat laporan
VI.            
HASIL PERCOBAAN DAN PEMBAHASAN
      Metode
paraffin termasuk metode sayatan yang banyak digunakan, karena hampir semua
jaringan dapat dipotong dengan metode ini. Pengamatan secara mikroskopis dari
suatu jaringan dalam berbagai kondisi dan berbagai elemen jaringan dapat
diamati atau diteliti melalui preparat permanen yang dibuat dengan metode
paraffin. Pembuatan preparat dengan metode paraffin adalah metode yang paling
umum digunakan untuk pembuatan preparat permanent, baik pada hewan ataupun pada
hewan (Anonim, 2011).
      Metode
parafin merupakan cara pembuatan preparat permanen yang menggunakan parafin
sebagai media embedding dengan tebal irisan kurang lebih mencapai 6 mikron-8
mikron. Metode ini memiliki irisan yang lebih tipis daripada menggunakan metode
beku atau metode seloidin yang tebal irisannya kurang lebih mencapai 10 mikron.
Langkah-langkah penting dalam metode ini antara lain fiksasi, pencucian, dehidrasi,
penjernihan, embedding, penyayatan (section), penempelan, pewarnaan, dan
penutupan. Larutan fiksasi yang digunakan untuk proses fiksasi adalah larutan
Bouine. Larutan fiksasi ini merupakan larutan yang mampu bereaksi dan menandai
suatu sel dengan spesimen diiris setipis mungkin. Hal ini mendukung laju
fiksasi dalam sel (Botanika 2008).
      Proses
pertama yang disiapkan dalam menyiapkan materi segar dalam pengamatan
mikroskopis yaitu fiksasi. Tujuan dilakukannya fiksasi adalah mencegah
kerusakan jaringan, menghentikan proses metabolisme secar cepat, mengawetkan
komponen sitologis dan histologis, mengawetkan keadaan sebenarnya, mengeraskan
materi yang lembek, dan jaringan-jaringan dapat diwarnai sehingga bisa
diketahui bagian-bagian jaringan.
      Faktor-faktor
yang berperan dalam fiksatif adalah buffer (pH), suhu yang rendah mencegah
autolisis,untuk mendapatkan daya penetrasi yang tinggi digunakan irisan setipis
mungkin, perubahan volume, osmolaliitas pada larutan fiksatif, penambahan
deterjen sehingga fiksatif cepat masuk, konsentrasi, dan waktu fiksatif.
Dehidrasi memiliki fungsi menghilangkan air dalam jaringan. Bahan yang
digunakan untuk dehidrasi harus mampu menggantikan fungsi air. Dehidrasi yang
baik dilakukan secara bertahap yaitu mulai dari konsentrasi 70% sesuai dengan
pelarut Bouin formol kemudian berturut-turut ke dalam alkohol 80%, 90%, 96% dan
alkohol absolut. Pada setiap konsentrasi dilakukan pengulangan 3 kali .
      Embedding
merupakan proses pelilinan suatu organ dengan menggunakan kotak kertas. Proses
ini memudahkan dalam membuat irisan yang sangat tipis dengan menggunakan
mikrotom. Beberapa keuntungan menggunakan kotak kertas dalam embedding yaitu
bisa membuat arah sayatan dan menandai suatu jaringan. Jaringan atau sampel
akan ditanam di ketas kotak, dengan terlebih dahulu parafin membeku pada bagian
dasar dalam kotak dan setelah penempelan jaringan dilanjutkan dengan penutupan
dengan parafin sampai membeku.
Gambar proses
embedding
Proses penyayatan (sectioning) diawali dengan
pengirisan blok parafin dengan scalpel, sehingga permukaan blok parafin yang
akan diiris dengan mikrotom berbentuk segi empat. Letak mata pisau pada
mikrotom menentukan hasil yang diperoleh. Hasil sayatan diambil dengan
menggunakan kuas secara hati-hati. Pita hasil sayatan ditempel pada kaca objek
dengan menggunakan meyer albumin. Kaca obyek tersebut diletakkan di atas meja
penangas ( haeting plate). Meyer albumin memiliki kandungan putih telur dan
gliserin dan merupakan pelakat alami yang sangat baik (Hugo 2008).Proses
pewarnaan dilakukan setelah preparat dideparafinasi dengan merendam preparat
pada xylol. Salah satu pewarna metode parafin pada jaringan hewan adalah
hematoxylin dan Eosin. Zat warna hematoxilin ini bersifat aquaosa.
Dengan adanya preparat utuh maka dapat diamati
bagian-bagian jaringan dan jenis sel yang ada dalam satu preparat. Dalam
pembuatan preparat utuh diupayakan permanen atau awet agar sewaktu-waktu dapat
diamati kembali. Dalam pembuatan preparat hendaknya dipahami karakteristik yang
akan diambil sebagai spesimen. Perbedaan karakteristik hewan yang akan diambil
sebagai spesimen menentukan larutan fiksatif dan zat warna yang akan digunkan
dalam pembuatan preparat (Setjo, 2004).
Karakteristik hewan yang akan diambil spesimennya
juga menentukan waktu pada tahap-tahap pemrosesan. Misalnya waktu yang berlebih
pada suatu tahap pengecatan akan mengakibatkan suatu warna menjadi terlalu
gelap dan mungkin warna lainnya menjadi kurang atau bahkan hilang. Keberhasilan
pembuatan preparat permanen ini tergantung pada lima tahap yang utama yaitu
fiksasi, dehidrasi, penjernihan, perembesan dan pengeblokan parafin serta
pewarnaan. Larutan fiksatif yang dipilih, perembesan parafin yang bagus dan zat
warna yang akan digunakan menentukan keberhasilan preparat irisan (Setjo,
2004).
Pada prinsipnya pembuatan preparat irisan terdiri
atas beberapa tahap yaitu koleksi specimen, fiksasi, dehidrasi, penjernihan,
infiltrasi, pengeblokan, pengirisan, penempelan, pewarnaan dan mounting.
Prinsip koleksi specimen adalah specimen tidak mengalami kekeringan dan
kerusakan sebelum difiksasi. Tujuan fiksasi adalah untuk mematikan dengan cepat
spesimen yang berupa jaringan dan sel-sel juga utuk mempertahankan struktur sel
dan jaringan sebagaimana aslinya. Udara dalam jaringan spesimen harus
dikeluarkan terlebih dahulu kemudian diganti dengan larutan fiksatif
(Widjajanto dan Susetyoadi Setjo, 2001).
Selanjutnya dilakukan dehidrasi yaitu tahap
pengeluaran air dari jaringan dengan perendaman alkohol secara bertingkat dan
dalam jangka waktu tertentu. Kemudian pengambilan alkohol dilakukan dengan
perendaman dalam xylol secara bertahap dengan jangka waktu tertentu. Proses
penggantian larutan penjernih dengan merendam spesimen dalam parafin.
Penggantian xylol dalam jaringan oleh parafin berlangsung secara
berangsur-angsur. Proses penggantian ini berlangsung di dalam oven sehingga
xylol tidak menguap dan parafin tidak membeku. Temperatur oven lebih tinggi
sedikit di atas titik cair parafin (Widjajanto dan Susetyoadi Setjo, 2001).
Selanjutnya dilakukan pengeblokan atau embedding,
pengeblokan ini mengguna-kan kotak atau takir yang dibuat dari kertas kalender.
Pada saat pengeblokan spesimen diletakkan sesuai posisi yang diinginkan.
Setelah itu parafin didinginkan dengan segera. Setelah dingin maka dilakukan
pengirisan, pengirisan digunakan alat mikrotom biasanya dengan ukuran 10 mikron
sampai 14 mikron. Irisan akan berbentuk seperti pita-pita. Pemindahan irisan
menggunakan kuas kecil yang telah dibasahi ujungnya dengan air (Widjajanto dan
Susetyoadi Setjo, 2001).
Penempelan menggunakan perekat albumin meyer
kemudian disimpan dalam kotak pengering (hot plate). Selanjutnya akan dilakukan
pewarnaan dan mounting. Dalam proses pewarnaan dilakukan dalam jangka waktu
tertentu, jika terlalu lama atau terlalu singkat dapat menyebabkan warna
preparat menjadi kurang atau bahkan terlalu gelap. Selanjutnya dilakukan
mounting dengan ditetesi balsam kanada sehingga irisan akan tetap awet dengan
struktur sel serta jaringan (Widjajanto dan Susetyoadi Setjo, 2001).
Proses penempelan spesimen ke kaca benda tidak
benar-benar melekat sehingga saat pewarnaan spesimen ada yang lepas. Agar
spesimen dapat menempel sempurna pada kaca benda dibutuhkan tenggat waktu yang
cepat antara peletakkan spesimen pada kaca benda yang telah diberi pelekat
berupa albumin meyer. Setelah benar-benar melekat di kaca benda maka irisan
yang berada di kaca benda dipanaskan di atas lampu spiritus untuk lebih
memaksimalkan perlekatannya (Widjajanto dan Susetyoadi Setjo, 2001).
Zat warna yang digunakan tidak hanya satu macam
karena tidak semua sel dapat menyerap satu macam zat warna. Pada saat pewarnaan
preparat jantung merpati inisel dalam jaringan tidak terwarnai. Hal ini dapat
disebabkan oleh waktu yang digunakan untuk pemberian warnanya terlalu singkat sehingga
zat warna belum terserap sempurna oleh jaringan. Pewarna yang diberikan pada
irisan dalam jangka waktu tertentu, kurang atau lebih waktu yang digunakan
menyebabkan warna preparat menjadi kurang atau terlalu gelap. Sedangkan hasil
preparat yang tidak utuh dapat disebabkan oleh suhu sekitar ruangan yang kurang
mendukung saat dilakukan pengirisan selain itu masih tersisanya air atau
alkohol dalam jaringan juga dapat menyulitkan dalam pengirisan.
Percobaan ini membuat preparat dengan menggunakan
jantung merpati dengan metode parafin. Jantung merpati  tersebut
dipotong secara melintang dengan ketebalan 10 mm.
Selanjutnya difiksasi menggunakan larutan alkohol 96% dengan
tujuan untuk menjaga atau mengawetkan seluruh stuktur sel sehingga sedapat
mungkin berada dalam keadaan sama atau hampir sama dengan keadaan aslinya pada
waktu masih hidup. Kemudian di dehidrasi dengan menggunakan alkohol
bertingkat yang dimulai dari konsentrasi 70%, 80%, 90%, dan
96% masing-masing selama 30 menit dan kemudian , dengan
tujuan untuk menghilangkan kandungan air. Selanjutnya melakukan
dealkoholosasi yang menggunkan perbandingan xilol :
alcohol yaitu 1:3, 1:1, dan 3:1 masing-masingselama 30 menit,
dengan tujuan mengeluaran alkohol dari jaringan tersebut juga maksimal sehingga
larutan xilol inilah yang nantinya dapat terikat langsung dengan parafin dan
agar jaringan akar tersebut dapat beradaptasi.
Selanjutnya dilakukan perendaman dengan menggunakan
xilol murni yaitu xilol I dan xilol II masing-masing 30 menit, dengan tujuan
agar jaringan betul-betul bebas dari alkohol sehingga hanya ada xilol yang
tersisa. kemudian dilanjutkan perendaman menggunakan perbandingan xilol :
parafin yaitu 1 : 9 selama 30 menit, dengan tujuan untuk menghilangkan xilol
dari jaringan. Kemudian melakukan infiltrasi dengan menggunakan parafin murni,
infiltrasi I dilakukan untuk mencelupkan, hal tersebut dilakukan untuk
menghilangkan kandungan xilol secara maksimum serta untuk merekatkan jaringan
dan infiltrasi II untuk mencetak kedalam box kecil yang sudah disediakan, hal
tersebut dilakukan agar jaringan dapat dengan mudah terpotong tanpa merusak
jaringan akar tersebut. Kemudian dilakukan pengirisan dengan menggunakan
mikrotom, namun hal ini tidak dilakukan karena alat tersebut sudah tidak dapat
digunakan lagi.
Kebaikan-kebaikan metoda ini adalah irisan yang
dihasilkan jauh lebih tipis dari pada menggunakan metoda beku atau metoda
seloidin. Dengan metoda beku, tebal irisan rata-rata diatas 10 mikron, tapi
dengan metode paraffin tebal irisan dapat mencapai rata-rata 6 mikron.
Irisan-irisan yang bersifat seri dapat dikerjakan dengan mudah bila menggunakan
metode ini. Prosedurnya jauh lebih cepat dibandingkan dengan metode seloidin.
Namun metode paraffin juga memiliki kelemahan yaitu jaringan menjadi keras,
mengerut dan mudah patah. Jaringan-jaringan yang besar tidak dapat dikerjakaan,
bila menggunakan metode ini. Sebagian besar enzim-enzim akan larut dengan
medode ini (Praptomo, 2010).
Pengamatan mikroskopis hepar merpati:
Dari pembesaran kecil sebuah sayatan dari sepotong
hepar, nampak sebagai kelompok lobuli yang secara kasar berisi enam, tiap –
tiap lobules dibungkus oleh jaringan ikat dan pada sudut – sudut tertentu
membentuk pulau pulau yang jelas juga mengandung pembuluh pembuluh darah dan
duktus. Pulau – pulau tersebut adalah kanalis portarum. Pada sisi yang lurus
dari lobulus, kadang dapat terlihat pembuluh – pembuluh yaitu vena
interlobulares. Susunan jaringan ikat yang mengitari lobulus lebih tipis,
hingga kurang jelas. Jaringan lobulus terdiri atas tali – tali radiar dari sel
– sel beralternasi dengan sinusoid – sinusoid. Sinusoid – sinusoid
berkonvergensi ke pembuluh di sentrum lobulus (vena sentralis)



VII.         
KESIMPULAN
      Kesimpulan
yang dapat diperoleh dari hasil percobaan yang telah dilakukan yaitu metode parafin
merupakan suatu cara pembuatan preparat yang menggunakan parafin sebagai media
penanamannya. Pembuatan preparat pada metode parafin ini terdiri dari beberapa
tahap yaitu narcose (pembiusan), sectio (pemotongan), labelling, fiksasi,
washing (pencucian), dehidrasi,  clearing
(penjernihan),  infiltrasi, embedding,
sectioning (pengirisan), affixing, staining (pewarnaan), mounting (penutupan),
dan labelling (pelabelan).
      Kebaikan-kebaikan
metoda ini adalah irisan yang dihasilkan jauh lebih tipis dari pada menggunakan
metoda beku atau metoda seloidin. Dengan metoda beku, tebal irisan rata-rata
diatas 10 mikron, tapi dengan metode paraffin tebal irisan dapat mencapai
rata-rata 6 mikron. Irisan-irisan yang bersifat seri dapat dikerjakan dengan
mudah bila menggunakan metode ini. Prosedurnya jauh lebih cepat dibandingkan
dengan metode seloidin. Namun metode paraffin juga memiliki kelemahan yaitu
jaringan menjadi keras, mengerut dan mudah patah. Jaringan-jaringan yang besar
tidak dapat dikerjakaan, bila menggunakan metode ini. Sebagian besar
enzim-enzim akan larut dengan medode ini.
VIII.      
DAFTAR PUSTAKA
Amanda,
2007, Membuat Preparat Melintang Dengan Metode Parafin,
http://monocotil.blogspot.com ,
Diakses pada tanggal 20 September 2011.
Botanika,
2008, Fixation, Embedding, Sectioning,
http://botanika.biologija.org ,
Diakses pada tanggal 20 September 2011.
Hugo. 2008.
Mayer Albumin. http://www.hardydiagnostics.com/catalog/hugo/MayersA
Plbumin.htm. Tanggal akses 7 November 2008
Lianury, Robby
N, 2000, Histologi, Universitas Hasanuddin Press, Makassar.
Praptomo,
2010, Pembuatan Preparat Parafin Jaringan Tumbuhan (Mikroteknik), 
http://www.nagkoyo.com ,
Diakses pada tanggal 20 September 2011.
Rina,
2011, Mikroteknik, 
http://rinaningtyas.blogspot.com ,
Diakses pada tanggal 20 September 2011.
Santoso, H. B.
2002. Bahan Kuliah Teknik Laboratorium. Universitas Lambung Mangkurat,
Banjarbaru
Setjo,
Susetyoadi, 2004, Anatomi Tumbuhan, Universitas Negeri Malang, Malang.
Tjiptrosoepomo,
G. 1993. Taksonomi Tumbuhan Spermatophyta.
       

BIologi Praktikum Metode Parafin Preparat

Related Post