Contoh Laporan Praktikum Embriologi Hewan – Pengamatan Sel Kelamin (Mencit) Anak Tikus

Laporan Praktikum Pembuatan Preparat Irisan Metode Parafin

Posted on

Berikut Kami sajikan contoh Laporan Praktikum Embriologi Hewan – Pembuatan Preparat Irisan Metode Parafin yang dapat di download

LAPORAN RESMI

PRAKTIKUM EMBRIOLOGI HEWAN

JUDUL : Pembuatan Preparat Irisan Metode Parafin

TUJUAN

        1. Mengetahui tahapan pembuatan preparat irisan metode parafin
        2. Membuat preparat irisan melalui penyelubungan dengan metode parafin menggunakan pewarnaan hematoxylin eosin

DASAR TEORI

Metode paraffin termasuk metode sayatan yang banyak digunakan, karena hampir semua jaringan dapat dipotong dengan metode ini. Pengamatan secara mikroskopis dari suatu jaringan dalam berbagai kondisi dan berbagai elemen jaringan dapat diamati atau diteliti melalui preparat permanen yang dibuat dengan metode paraffin. Pembuatan preparat dengan metode paraffin adalah metode yang paling umum digunakan untuk pembuatan preparat permanent, baik pada tumbuhan ataupun pada hewan (Anonim, 2011).

Metode parafin adalah suatu metode pembuatan preparat dengan melakukan penanaman jaringan di dalam blok parafin untuk menghasilkan preparat jaringan hewan ataupun tumbuhan yang tipis. Preparat parafin ini dilakukan penyelubungan karena jaringan merupakan bahan yang lunak. Pembuatan sediaan dengan pemotongan jaringan menggunakan parafin dan mikrotom sebagai alat pemotongnya. Dilakukan infiltrasi agar parafin yang masuk berfungsi sebagai penyangga jaringan saat diiris dengan mikrotom, lalu diembedding (proses penanaman) yaitu merendam jaringan ke dalam parafin cair, dan parafin akan masuk ke seluruh bagian jaringan, proses pemotongan dengan mikrotom, penempelan pada kaca objek, pewarnaan dengan haematoksilin (pada umumnya bahan ini yang sering digunakan untuk jaringan hewan) sedangkan jaringan tumbuhan seringkali menggunakan safranin ataupun fast green. Setelah diwarnai lalu dimounting, diberi perekat entellan, dan diberi label nama (Tjiptrosoepomo, 1993).

Prosedur pembuatan sediaan menggunakan metode parafin pada umumnya sama baik pada jaringan hewan maupun tumbuhan. Pertama–tama organ yang akan dijadikan preparat diisolasi terlebih dahulu, kemudian difiksasi minimal 24 jam, didehidrasi dengan alkohol bertingkat selama 30 menit, diclearing dengan xilol murni juga selama 30 menit, diinfiltrasi agar parafin yang masuk berfungsi sebagai penyangga jaringan saat diiris dengan mikrotom, lalu diembedding (proses penanaman) yaitu merendam jaringan ke dalam parafin cair, dan parafin akan masuk ke seluruh bagian jaringan, proses pemotongan dengan mikrotom, penempelan pada kaca objek, pewarnaan dengan haematoksilin (pada umumnya bahan ini yang sering digunakan untuk jaringan hewan) sedangkan jaringan tumbuhan seringkali menggunakan safranin ataupun fast green. Setelah diwarnailalu dimounting, diberi perekat entellan, dan diberi label nama (Santoso, 2002).

Pada organ hewan, Embedding merupakan proses pelilinan suatu organ dengan menggunakan kotak kertas. Proses ini memudahkan dalam membuat irisan yang sangat tipis dengan menggunakan mikrotom. Beberapa keuntungan menggunakan kotak kertas dalam embedding yaitu bisa membuat arah sayatan dan menandai suatu jaringan. Jaringan atau sampel akan ditanam di ketas kotak, dengan terlebih dahulu parafin membeku pada bagian dasar dalam kotak dan setelah penempelan jaringan dilanjutkan dengan penutupan dengan parafin sampai membeku.

Proses penyayatan (sectioning) diawali dengan pengirisan blok parafin dengan scalpel, sehingga permukaan blok parafin yang akan diiris dengan mikrotom berbentuk segi empat. Letak mata pisau pada mikrotom menentukan hasil yang diperoleh. Hasil sayatan diambil dengan menggunakan kuas secara hati-hati. Pita hasil sayatan ditempel pada kaca objek dengan menggunakan meyer albumin. Kaca obyek tersebut diletakkan di atas meja penangas ( haeting plate). Meyer albumin memiliki kandungan putih telur dan gliserin dan merupakan pelakat alami yang sangat baik (Hugo 2008).Proses pewarnaan dilakukan setelah preparat dideparafinasi dengan merendam preparat pada xylol. Salah satu pewarna metode parafin pada jaringan hewan adalah hematoxylin dan Eosin. Zat warna hematoxilin ini bersifat aquaosa.

Ada beberapa macam paraffin yaitu paraffin lunak dengan titik leleh 48oC, paraffin medium dengan titik leleh 52oC, dan paraffin keras dengan titik leleh 56oC. Waktu yang dibutuhkan di setiap tahapan paraffin yaitu 15-20 menit. Tidak perlu waktu yang cukup lama karena dilakukan di dalam oven yang menyebabkan jaringan kuat dan rapuh (Botanika, 2008).

Embedding dilakukan dengn membuat kotak kertas. Beberapa keuntungan menggunakan kotak kertas yaitu bisa membuat arah sayatan dan menandai jaringan. Sebelum jaringan atau sampel ditanam maka terlebih dahulu paraffin dalam kotak harus membeku pada bagian dasarnya sehingga memungkinkan objek tidak langsung menempel pada dasar kertas. Blok paraffin yang akan disayat dulu maka dibentuk dulu (trimming). Bentuk blok disesuaikan dengan bentuk pitanya yang diinginkan. Hal in dikarenakan penampang blok paraffin menggambarkan blok pita yangg akan diiris.Letak mata pisau pada mikrotom sangat menentukan hasil yang diperoleh. Pisau dibersihan dengan xylol dari sisa-sisa paraffin yang menempel. Hasil sayatan diambill dengan menggunakan kuas secara hati-hati. Hasil sayatan diletakkan dalam bak khhusuus dann diperhatikan urutannya. Pita hasil sayatan ditempel pada kaca objek dengan menggunakan meyer albumin. Kaca objek selanjutnya diletakkan di atas meja penangans (heating plate) (Botanika, 2008). Meyer albumin memiliki kandungan putih telur dan gliserin dan merupakan pelekat alami yang sangat baik (Hugo, 2008).

Sangatlah penting dilakukan rehidrasi atau dehidrasi sebelum dilakukan pewarnaan. Hal itu baru dilakukan bila paraffin dalam sayatan sudah larut dan biasanya dilarutkan dalam xylol (Botanika, 2008).

Proses sectioning diawali dengan pengirisan blok parafin dengan scalpel, sehingga permukaan blok parafin yang akan diiris dengan mikrotom berbentuk segi empat. Irislah sedemikian rupa, sehingga preparat akan terletak tepat berada di tengah blok. Proses pewarnaan dilakukan setelah preparat dideparafinasindengan merendam preparat pada xylol. Salah satu pewarna metode parafin pada jaringan hewan adalah hematoxylin dan Eosin. Zat warna hematoxilin ini bersifat aquaosa

Mikrotom ada beberapa macam yaitu :

  1. Mikrotom geser (sliding mikrotome). Pada alat ini, jaringan tetap berada pada tempatnya, sedang pisaunya yang bergerak. Pada umumnya jaringan yang akan dipotong dengan mikrotom geser adalah jaringan yang tanpa penanaman (embedding) terlebih dulu. Disini tidak akan terjadi pita irisan. Jaringan yang akan diiris sebelumnya dapat diwarnai dengan pewarnaan tunggal, ataupun tanpa pewarnaan terlebih dahulu. Metode ini banyak dikerjakan untuk pengirisan jaringan tumbuh-tumbuhan.
  2. Mikrotom beku (freezing microtome). Alat ini dihubungkan dengan tabung berisi CO2 dingin, melalui suatu pipa karet. Mikrotom ini, keadaannya sama dengan mikrotom geser yaitu jaringan tetap berada pada tempatnya sedang pisau mikrotomnya yang bergerak ke muka dan ke belakang.
  3. Mikrotom putar (rotary microtome). Berbeda dengan 2 jenis mikrotom diatas, yaitu bahwa pada mikrotom ini, pisau tetap pada tempatnya sedang jaringannya yang bergerak ke atas dan ke bawah. Jenis mikrotom ini yang biasanya digunakan untuk pembuatan sediaan irisan dengan metode parafin (Rina, 2010).

Karena metode parafin sekarang lebih banyak digunakan di laboratorium-laboratorium, maka dengan sendirinya mikrotom jenis ini lebih banyak digunakandaripada mikrotom-mikrotom lainnya. Hal ini disebabkan karena irisan yangdiperoleh lebih tipis dibandingkan dengan metode lainnya (Rina, 2010).

Ada 2 macam metode irisan adalah sebagai berikut:

1. Metode irisan dengan tangan.

Pada beberapa macam jaringan, terutama dalam lapangan botani, pembuatan sediaan dengan cara ini masih dapat dipakai misalnya melihat susunan daun segar. Dengan mempelajari sediaan seperti ini dapat diperoleh beberapa keterangan mengenai luas maupun tipe fibrosis didalam jaringanyang patologis

2. Metode pembuatan secara parafin menggunakan irisan dengan peralalan mikrotom.

Di dalam menggunakan metode ini sediaan didapat dari jaringan-jaringan pengirisannya menggunakan suatu alat yang disebut mikrotom. Keuntungan dari alat ini adalah bahwa tebal irisan dapat diatur menurut tajam dankehendak peneliti. Macam-macam mikrotom diantaranya mikrotom geser, mikrotom beku, dan mikrotom putar (rotary mikrotom) (Mcmanus, 1992).

 

ALAT DAN BAHAN

Alat

  1. Papan paraffin 1 buah
  2. Pisau bedah 1 buah
  3. Jarum pentul secukupnya
  4. Gunting bedah 1 buah
  5. Cawan petri 1 buah
  6. Pinset 1 buah
  7. Gelas bekker 1 buah
  8. Objek glass 9 buah
  9. Deg glass 9 buah
  10. Kuas 1 buah
  11. Staining jar 1 buah
  12. Tabung untuk fiksasi 1 buah
  13. Gelas-gelas petri secukupnya
  14. Mikrotom 1 buah
  15. Hot plate 1 buah
  16. Mikroskop 1 buah

 

Bahan

  1. Lambung katak (Rana sp) 1 buah
  2. Alcohol 70%, 80%, 90%, 96%, absolute (100%) secukupnya
  3. Larutan xylol secukupnya
  4. Paraffin secukupnya
  5. Larutan Bouine secukupnya
  6. Larutan hematocilin secukupnya
  7. Eosin secukupnya
  8. Larutan Entellan secukupnya
  9. Aquades secukupnya
  10. Meyer albumin secukupnya
  11. Larutan ringer secukupnya

 

CARA KERJA

  1. Narcose (pembiusan), kapas dibasahi dengan eter kemudian ditempelkan pada nares anterior katak
  2. Section (pemotongan) dilakukan section dengan hati-hati hingga diperoleh potongan organ yang akan diawetkan sebesar 3-5 mm, kemudian darah atau kotoran yang menempel dibersihkan dengan garam fisiologis
  3. Labeling (pelabelan), dibuat label yang sesuai dan ditempelkan pada potongan jaringan (ditempel di luar botol). Organ dimasukkan ke dalam larutan fiksatif
  4. Fiksasi, potongan jaringan yang telah belabel dimasukkan dalam botol-botol flakon yang sudah berisi larutan fiksatif selama 24jam
  5. Washing (pencucian), potongan jaringan yang telah terfiksasi dicuci langsung degan alcohol 70% yang sekaligus untuk mengusir piktatnya hingga warna kuning hilang. Alcohol 70% di sini sebagai stopping point
  6. Dehidrasi, organ-organ tersebut dicuci dengan alcohol bertingkat, yaiut 80%, 90%, 96% dan alcohol absolute secara bergantian dengan cara 2×30 menit untuk masing-masing alcohol
  7. Clearing (penjernihan), potongan jaringan atau norgan dipindahkan ke dalam botol yang berisi toluol selama semalam hingga didapatkan organ tersebut menjadi transparan
  8. Infiltrasi, dilakukan di dalam oven atau incubator dengan temperature 55-60°C organ dilarutkan ke dalam larutan xylol + paraffin dengan perbandingan 1:1 yang dimasukkan dalam gela beker. Kemudian pada deretan paraffin murni I, II, III. Potongan organ berturut-turut dipindahkan ke dalm gelas-gelas bekker tersebut masing-masing 1jam
  9. Embedding (penyelubungan), disiapkan temapat paraffin yang akan digunakan untuk menahan potongan jaringan dari karton atau kertas kalender yang dibuat kotak-kotak sebesar 2x2x2 cm. masukkan paraffin ke dalam kotak-kotak tersebut hingga penuh. Kemudian potongan jaringan segera dipindahkan ke dalam paraffin cair tersebut, diatur letaknya menurut rencana pemotongan, akan diiris melintang atau membujur
  10. Sectioning (pengirisan), blok-blok paraffin dikeluarkan dari cetakannya kemudian dibentuk dengan cara mengiris dengan scalpel sedemikian rupa sehingga permukaan yang akan diiris dengan pisau mikrotom berbentuk segiempat teratur, semua sisinya sejajar. Blok paraffin diletakkan pada holder kayu sehingga melekat erat, caranya dengan mencairkan sedikit paraffin kemudian ditaru pada holder dan blok paraffin diletakkan padanya hingga tidak goyah lagi. Kemudian holder bersama blok paraffin diparang pada rotary mikrotom dan dimantapkan. Diiris dengan rotary mikrotom dengan ketebalan 5 mikron. Disiapkan kertas putih untuk kertas pita preparat serta kuas untuk mengambil coopes dari pisau mikrotom pada tempatnya di mikrotom
  11. Affixing, obyek glass ditetesi dengan albumen mayer selanjutnya ditetesi dengan aquades secukupnya, coopes yang terpilih diletakkan di atas obyek glass tersebut dan direntangkan. Kemudian obyek glass tersebut diletakkan di atas hot plates yang bersuhu 40-45°C diatur letak coupesnya, rentangkan apabila terlipat, akuades yang berlebih dihisap dengan pipet atau kertas penghisap dibiarkan hingga kering
  12. Staining (pewarnaan)
  13. Disiapkan larutan alcohol bertingkat, akuades, larutan pewarna hematicilin, dan eosin masing-masing dalam straining jaringan disusun sesuai urutan prosesinya, satinning jaringan harus segera tertutup setelah digunakan karena alcohol atau xylol mudah menguap
  14. Deparafinisasi dengan xylolminimal 15menit (sampai paraffin larut), coupes harus terendam oleh xylol
  15. Dilap dengan kertas hisap
  16. Dimasukkan alcohol bertingkat 96% sampai dengan alcohol 30% dan akuades masing-masing 1 celupan
  17. Diwarnai dengan hemaktosilin 3-7 detik, dibersihkan dengan cara dicelup-celup secara hati-hati di akuades atau air biasa
  18. Dicuci dengan air mengalir selama 3 menit
  19. Dimasukkan ke dalam alcohol bertingkat 30%-70% masing-masing 1 celupan
  20. Diwarnai dengan eosin 15-30%
  21. Dicuci dengan alcohol 70% bilas sampai obyek glass bersih atau tidak merah
  22. Dimasukkan lagi ke alcohol 70%-96% masing-masing 1 kali celupan
  23. Ditetesi dengan alcohol absolute
  24. Dilap dengan kertas hisap
  25. Dimasukkan ke dalam xylol selama 15 menit
  26. Dilap dengan kertas denga kertas hisap
  27. Mounting (penutupan)
  28. Canada balsam diteteskan di atas coupes ditutup dengan kertas penutup
  29. Diletakkan di atas hot plate agar cepat kering
  30. Dilakukan pemerikasaan di bawah mikroskop untuk melihat afinitas jaringan terhadap zat warna bila hasil pewarnaan jelek tidak perlu di tutup dengan Canada balsam dfan deg glass
  31. Labeling, ditulis data lengkap dengan preparat yang telah dibuat pada label yang kemudian ditempel pada salah satu sisi obyek glass
  32. Preparat yang telah berhasil dibuat digambar secara lengkap dan dibuat laporan
Menarik Lainnya  BIOLOGI LINGKUNGAN (PENGERTIAN EKOLOGI, FAKTOR BIOTIK ABIOTIK DAN ADAPTASI)

 

HASIL PERCOBAAN DAN PEMBAHASAN

Metode parafin adalah suatu cara pembutan sediaan baik itu tumbuhanataupun hewan dengan menggunakan parafin. Kebaikan-kebaikan metode ini ialah irisan jauh lebih tipis dari pada menggunakan metoda beku atau metoda seloidin. Dengan metoda beku, tebal irisan rata-rata diatas 10 mkron, tapi dengan metode parafin tebal irisan dapat mencapai rata-rata 6 mikron. Irisan-irisan yang bersifat seri dapat dikerjakan dengan mudah bila menggunakan metode ini. Kelemahan dari metode ini ialah jaringan menjadi keras, mengerut dan mudah patah. Jaringan-jaringan yang besar tidak dapat dikerjakaan, bila menggunakan metode ini. Sebagian besar enzim-enzim yang terdapat pada jaringan akan larutdengan menggunakan metode ini (Santoso, 2002).

Metode paraffin termasuk metode sayatan yang banyak digunakan, karena hampir semua jaringan dapat dipotong dengan metode ini. Pengamatan secara mikroskopis dari suatu jaringan dalam berbagai kondisi dan berbagai elemen jaringan dapat diamati atau diteliti melalui preparat permanen yang dibuat dengan metode paraffin. Pembuatan preparat dengan metode paraffin adalah metode yang paling umum digunakan untuk pembuatan preparat permanent, baik pada hewan ataupun pada hewan (Anonim, 2011).

Metode parafin merupakan cara pembuatan preparat permanen yang menggunakan parafin sebagai media embedding dengan tebal irisan kurang lebih mencapai 6 mikron-8 mikron. Metode ini memiliki irisan yang lebih tipis daripada menggunakan metode beku atau metode seloidin yang tebal irisannya kurang lebih mencapai 10 mikron. Langkah-langkah penting dalam metode ini antara lain fiksasi, pencucian, dehidrasi, penjernihan, embedding, penyayatan (section), penempelan, pewarnaan, dan penutupan. Larutan fiksasi yang digunakan untuk proses fiksasi adalah larutan Bouine. Larutan fiksasi ini merupakan larutan yang mampu bereaksi dan menandai suatu sel dengan spesimen diiris setipis mungkin. Hal ini mendukung laju fiksasi dalam sel (Botanika 2008).

Proses pertama yang disiapkan dalam menyiapkan materi segar dalam pengamatan mikroskopis yaitu fiksasi. Tujuan dilakukannya fiksasi adalah mencegah kerusakan jaringan, menghentikan proses metabolisme secar cepat, mengawetkan komponen sitologis dan histologis, mengawetkan keadaan sebenarnya, mengeraskan materi yang lembek, dan jaringan-jaringan dapat diwarnai sehingga bisa diketahui bagian-bagian jaringan.

Faktor-faktor yang berperan dalam fiksatif adalah buffer (pH), suhu yang rendah mencegah autolisis,untuk mendapatkan daya penetrasi yang tinggi digunakan irisan setipis mungkin, perubahan volume, osmolaliitas pada larutan fiksatif, penambahan deterjen sehingga fiksatif cepat masuk, konsentrasi, dan waktu fiksatif. Dehidrasi memiliki fungsi menghilangkan air dalam jaringan. Bahan yang digunakan untuk dehidrasi harus mampu menggantikan fungsi air. Dehidrasi yang baik dilakukan secara bertahap yaitu mulai dari konsentrasi 70% sesuai dengan pelarut Bouin formol kemudian berturut-turut ke dalam alkohol 80%, 90%, 96% dan alkohol absolut. Pada setiap konsentrasi dilakukan pengulangan 3 kali .

Selanjutnya adalah tahapan Dehidrasi yang tahap ini bertujuan menarik air dari jaringan tumbuhan agar kemudiandapat dikenakan larutan yang dapat bercampur atau larut dalam parafin yangdigunakan sebagai alat dimana bahan akan ditanam. Dehidrasi seringkali dilakukan dengan seri alcohol-xylol atau alkohol TBA. Bahan kimia untuk dehidrasimempunyai sifat antara lain; mengeluarkan air dari jaringan, menggantikan dandigantikan oleh bahan penjernih (clearing), tidak mengubah sifat sediaan yang telah difiksasi. Proses ini dimulai dengan perendaman pada larutan alkohol bertingkatdengan konsentrasi mulai dari 40%, 60%, 80%, 95%, dan 100% .Digunakan alkohol bertingkat tersebut agar jaringan kandungan airnya dapat keluar sedikit demi sedikit hingga pada konsentrasi 100% pengeluaran airnya pun maksimal (Suryana,2009).

Tahapan Clearing adalah tahapan setelah dehidrasi ini disebut juga pembeningan atau penjernihan, karena dengan proses tersebut menyebabkan bahan menjadi beningatau jernih. Tahap ini bertujuan untuk menghilangkan bahan kimia dehidrasi sehingga contoh sampel menjadi transparan. Bahan clearing ini mempunyai sifat mampu menggantikan mengantikan bahan kimia dehidrasi, mampu melarutkan parafin. Bahan yang dipergunakan adalah xylol. Xilol berfungsi untuk menjernihkan (clearing) jaringan dari alkohol (dealkoholisasi), zat antara yangdapat larut dalam alkohol sekaligus dalam parafin (Suryana,2009).

Tahapan berikutnya Impregnasi adalah merupakan teknis histologi ini untuk menyusupkan paraffin ke dalam jaringan sampeluntuk menggantikan xylol yang telah hilang, sehingga sampel tidak rusak waktu pemotongan dengan mikrotom. Impregnasi, yaitu campuran paraffin dan xyloldiganti dengan paraffin murni yang bertujuan untuk menghilangkan kandungan xylolnya secara maksimum serta untuk merekatkan jaringan.( Anonim,1997)

Infiltrasi adalah suatu usaha menyusupkan media penanaman (embedding media) ke dalam jaringan dengan jalan menggantikan kedudukan dehidran dan bahan penjernih (clearing agents). Media penanaman yang digunakan dalam infiltrasi ini adalah paraffin. Proses infiltrasi ini umumnya dilakukan di dalam oven yang suhunya dapat diatur sesuai titik leleh jenis paraffin yang digunakan. Pada jaringan hewan bisa langsung digunakan paraffin keras dengan titik leleh 56-58C.
Dalam proses infiltrasi sebaiknya jaringan jangsn langsung dimasukan ke dalam paraffin murni, tetapi sebelum paraffin murni jaringan dimasukkan terlebih dahulu ke dalam campuran bahan penjernih dan paraffin murni dengan perbandingkan yang sama. Waktu yang diperlukan jaringan campuran ini terlalu lama cukup berkisar antara 10-30 menit saja tergantung besar kecilnya jaringan. Tujuan dari semua ini adalah untuk menghindari jaringan dsri prubshsn lingkungsn yang sangat mendadak. Perubahan-perubahan yang mendadak ini dapat menimbulkan kerusakan pada jaringan itu sendiri, seperti jaringan menjadi sangat mengkerut,dll.
Setelah dalam campuran paraffin dan bahan penjernih, jaringan baru dipindahkan ke paraffin murni sebanyak tiga kali ganti yang masing-masingnya berkisar antara 30-60 menit. Usahakan jaringan jangan terlalu lama ditinggalkan dalam oven. Tujuan dari tahap infiltrasi ini adalah untuk mengisi jaringan dengan paraffin sebagi pengikat jaringan agar tetap memiliki bentuk dan struktur yang sama seperti hidup.

Embedding merupakan proses pelilinan suatu organ dengan menggunakan kotak kertas. Proses ini memudahkan dalam membuat irisan yang sangat tipis dengan menggunakan mikrotom. Beberapa keuntungan menggunakan kotak kertas dalam embedding yaitu bisa membuat arah sayatan dan menandai suatu jaringan. Jaringan atau sampel akan ditanam di ketas kotak, dengan terlebih dahulu parafin membeku pada bagian dasar dalam kotak dan setelah penempelan jaringan dilanjutkan dengan penutupan dengan parafin sampai membeku.

Gambar proses embedding

Proses penyayatan (sectioning) diawali dengan pengirisan blok parafin dengan scalpel, sehingga permukaan blok parafin yang akan diiris dengan mikrotom berbentuk segi empat. Letak mata pisau pada mikrotom menentukan hasil yang diperoleh. Hasil sayatan diambil dengan menggunakan kuas secara hati-hati. Pita hasil sayatan ditempel pada kaca objek dengan menggunakan meyer albumin. Kaca obyek tersebut diletakkan di atas meja penangas ( haeting plate). Meyer albumin memiliki kandungan putih telur dan gliserin dan merupakan pelakat alami yang sangat baik (Hugo 2008).Proses pewarnaan dilakukan setelah preparat dideparafinasi dengan merendam preparat pada xylol. Salah satu pewarna metode parafin pada jaringan hewan adalah hematoxylin dan Eosin. Zat warna hematoxilin ini bersifat aquaosa.

Hal-hal yang harus diperhatikan dalam proses penyayatan ini adalah:

  1. Mikrotom harus seberat mungkin
  2. Meja tempat mikrotom harus stabil
  3. Pisau harus cocok dengan mikrotom
  4. Posisi pisau harus stabil
  5. Mata bisau harus tajam, bersih dan suhunya harus sama dengan balok jaringan yang akan disayat.

Selanjutnya Affixing adalah proses pelekatan atau penempatan sayatan jaringan pada kaca objek dengan bantuan media pelekat tertentu. Tujuan penempelan ini adalah untuk menempelkan pita paraffin yang sudah berisi sayatan jaringan pada kaca objek.

Deparafinasi adalah suatu tahap menjelang proses pewarnaan dengan menggunakan xilol untuk membersihkan paraffin dari jaringan dan kaca objek. Pengerjaan deparafinasi aserial atau berkelanjutan dengan pengerjaan pewarnaan. Tujuan dari tahap ini untuk membersihkan jaringan dan kaca objek dari paraffin.

Pewarnaan merupakan suatu tahap dalam mikroteknik untuk mempertajam atau memperjelas berbagai elemen jaringan, terutama sel-seknya, sehingga dapat dibedakan dan ditelaah dengan mikroskop.tanpa pewarnaan, jaringan akan transparan sehingga sulit untuk diamati.

Pewarnaan akan memperjelas rinci suatu jaringan sehinnga mudah untuk dipelajari. Pewarnaan dibedakan antara non vital dengan vital
a. Pewarnaan non vital, pewarnaan dilakukan setelah jaringan dimatikan melalui fiksasi. Teknik ini merupakan teknik dan cara yang paling alzim digunakan, terutama untuk pekerjaan rutin sehari-hari, terutama pembuatan preparat/sediaan praktikum bagi mahasiswa.
b. Pewarnaan vital, maka proses pewarnaan dilakukan selagi jaringan/sel masih dalam keadaan hidup. Sel-sel yang masih hidup tersebut diharapkan mampu untuk menyerap warna maupun mengikat/memfagosit partikel-partikel zat warna. Dengan demikian zat warna yang hendaknya yang tidak bersifat toksik bagi sel-sel tersebut. Sebagai contoh, tinta china dan lithium carmine secara umum digunakan untuk mengamati penyebaran sifat sel-sel RES, karena sel-sel tersebut mampu memfagosit zat warna.
c. Pewarnaan supra-vital diharapkan pada hasil kultur sel dan jaringan. Dalam arti yang sangat luas, zat warna mencakup bahan organic dan bahan anorganik, yang mengadakan ikatan dengan jaringan lebih jelas untuk diamati. Ditinjau dari berbagai segi, maka zat warna dapat kita bedakan atau kelompokan pada kategori-kategori tertentu. Berikut ini adalah pembagian zat warna bergasarkan berbagai kategori tersebut.

Menarik Lainnya  Cara membuat kompos dengan sederhana

Dengan adanya preparat utuh maka dapat diamati bagian-bagian jaringan dan jenis sel yang ada dalam satu preparat. Dalam pembuatan preparat utuh diupayakan permanen atau awet agar sewaktu-waktu dapat diamati kembali. Dalam pembuatan preparat hendaknya dipahami karakteristik yang akan diambil sebagai spesimen. Perbedaan karakteristik hewan yang akan diambil sebagai spesimen menentukan larutan fiksatif dan zat warna yang akan digunkan dalam pembuatan preparat (Setjo, 2004).

Karakteristik hewan yang akan diambil spesimennya juga menentukan waktu pada tahap-tahap pemrosesan. Misalnya waktu yang berlebih pada suatu tahap pengecatan akan mengakibatkan suatu warna menjadi terlalu gelap dan mungkin warna lainnya menjadi kurang atau bahkan hilang. Keberhasilan pembuatan preparat permanen ini tergantung pada lima tahap yang utama yaitu fiksasi, dehidrasi, penjernihan, perembesan dan pengeblokan parafin serta pewarnaan. Larutan fiksatif yang dipilih, perembesan parafin yang bagus dan zat warna yang akan digunakan menentukan keberhasilan preparat irisan (Setjo, 2004).

Pada prinsipnya pembuatan preparat irisan terdiri atas beberapa tahap yaitu koleksi specimen, fiksasi, dehidrasi, penjernihan, infiltrasi, pengeblokan, pengirisan, penempelan, pewarnaan dan mounting. Prinsip koleksi specimen adalah specimen tidak mengalami kekeringan dan kerusakan sebelum difiksasi. Tujuan fiksasi adalah untuk mematikan dengan cepat spesimen yang berupa jaringan dan sel-sel juga utuk mempertahankan struktur sel dan jaringan sebagaimana aslinya. Udara dalam jaringan spesimen harus dikeluarkan terlebih dahulu kemudian diganti dengan larutan fiksatif (Widjajanto dan Susetyoadi Setjo, 2001).

Selanjutnya dilakukan dehidrasi yaitu tahap pengeluaran air dari jaringan dengan perendaman alkohol secara bertingkat dan dalam jangka waktu tertentu. Kemudian pengambilan alkohol dilakukan dengan perendaman dalam xylol secara bertahap dengan jangka waktu tertentu. Proses penggantian larutan penjernih dengan merendam spesimen dalam parafin. Penggantian xylol dalam jaringan oleh parafin berlangsung secara berangsur-angsur. Proses penggantian ini berlangsung di dalam oven sehingga xylol tidak menguap dan parafin tidak membeku. Temperatur oven lebih tinggi sedikit di atas titik cair parafin (Widjajanto dan Susetyoadi Setjo, 2001).

Selanjutnya dilakukan pengeblokan atau embedding, pengeblokan ini mengguna-kan kotak atau takir yang dibuat dari kertas kalender. Pada saat pengeblokan spesimen diletakkan sesuai posisi yang diinginkan. Setelah itu parafin didinginkan dengan segera. Setelah dingin maka dilakukan pengirisan, pengirisan digunakan alat mikrotom biasanya dengan ukuran 10 mikron sampai 14 mikron. Irisan akan berbentuk seperti pita-pita. Pemindahan irisan menggunakan kuas kecil yang telah dibasahi ujungnya dengan air (Widjajanto dan Susetyoadi Setjo, 2001).

Penempelan menggunakan perekat albumin meyer kemudian disimpan dalam kotak pengering (hot plate). Selanjutnya akan dilakukan pewarnaan dan mounting. Dalam proses pewarnaan dilakukan dalam jangka waktu tertentu, jika terlalu lama atau terlalu singkat dapat menyebabkan warna preparat menjadi kurang atau bahkan terlalu gelap. Selanjutnya dilakukan mounting dengan ditetesi balsam kanada sehingga irisan akan tetap awet dengan struktur sel serta jaringan (Widjajanto dan Susetyoadi Setjo, 2001).

Proses penempelan spesimen ke kaca benda tidak benar-benar melekat sehingga saat pewarnaan spesimen ada yang lepas. Agar spesimen dapat menempel sempurna pada kaca benda dibutuhkan tenggat waktu yang cepat antara peletakkan spesimen pada kaca benda yang telah diberi pelekat berupa albumin meyer. Setelah benar-benar melekat di kaca benda maka irisan yang berada di kaca benda dipanaskan di atas lampu spiritus untuk lebih memaksimalkan perlekatannya (Widjajanto dan Susetyoadi Setjo, 2001).

Zat warna yang digunakan tidak hanya satu macam karena tidak semua sel dapat menyerap satu macam zat warna. Pada saat pewarnaan preparat jantung merpati inisel dalam jaringan tidak terwarnai. Hal ini dapat disebabkan oleh waktu yang digunakan untuk pemberian warnanya terlalu singkat sehingga zat warna belum terserap sempurna oleh jaringan. Pewarna yang diberikan pada irisan dalam jangka waktu tertentu, kurang atau lebih waktu yang digunakan menyebabkan warna preparat menjadi kurang atau terlalu gelap. Sedangkan hasil preparat yang tidak utuh dapat disebabkan oleh suhu sekitar ruangan yang kurang mendukung saat dilakukan pengirisan selain itu masih tersisanya air atau alkohol dalam jaringan juga dapat menyulitkan dalam pengirisan.

Percobaan ini membuat preparat dengan menggunakan jantung merpati dengan metode parafin. Jantung merpati  tersebut dipotong secara melintang dengan ketebalan 10 mm. Selanjutnya difiksasi menggunakan larutan alkohol 96% dengan tujuan untuk menjaga atau mengawetkan seluruh stuktur sel sehingga sedapat mungkin berada dalam keadaan sama atau hampir sama dengan keadaan aslinya pada waktu masih hidup. Kemudian di dehidrasi dengan menggunakan alkohol bertingkat yang dimulai dari konsentrasi 70%, 80%, 90%, dan 96% masing-masing selama 30 menit dan kemudian , dengan tujuan untuk menghilangkan kandungan air. Selanjutnya melakukan dealkoholosasi yang menggunkan perbandingan xilol : alcohol yaitu 1:3, 1:1, dan 3:1 masing-masingselama 30 menit, dengan tujuan mengeluaran alkohol dari jaringan tersebut juga maksimal sehingga larutan xilol inilah yang nantinya dapat terikat langsung dengan parafin dan agar jaringan akar tersebut dapat beradaptasi.

Selanjutnya dilakukan perendaman dengan menggunakan xilol murni yaitu xilol I dan xilol II masing-masing 30 menit, dengan tujuan agar jaringan betul-betul bebas dari alkohol sehingga hanya ada xilol yang tersisa. kemudian dilanjutkan perendaman menggunakan perbandingan xilol : parafin yaitu 1 : 9 selama 30 menit, dengan tujuan untuk menghilangkan xilol dari jaringan. Kemudian melakukan infiltrasi dengan menggunakan parafin murni, infiltrasi I dilakukan untuk mencelupkan, hal tersebut dilakukan untuk menghilangkan kandungan xilol secara maksimum serta untuk merekatkan jaringan dan infiltrasi II untuk mencetak kedalam box kecil yang sudah disediakan, hal tersebut dilakukan agar jaringan dapat dengan mudah terpotong tanpa merusak jaringan akar tersebut. Kemudian dilakukan pengirisan dengan menggunakan mikrotom, namun hal ini tidak dilakukan karena alat tersebut sudah tidak dapat digunakan lagi.

Kebaikan-kebaikan metoda ini adalah irisan yang dihasilkan jauh lebih tipis dari pada menggunakan metoda beku atau metoda seloidin. Dengan metoda beku, tebal irisan rata-rata diatas 10 mikron, tapi dengan metode paraffin tebal irisan dapat mencapai rata-rata 6 mikron. Irisan-irisan yang bersifat seri dapat dikerjakan dengan mudah bila menggunakan metode ini. Prosedurnya jauh lebih cepat dibandingkan dengan metode seloidin. Namun metode paraffin juga memiliki kelemahan yaitu jaringan menjadi keras, mengerut dan mudah patah. Jaringan-jaringan yang besar tidak dapat dikerjakaan, bila menggunakan metode ini. Sebagian besar enzim-enzim akan larut dengan medode ini (Praptomo, 2010).

Pengamatan mikroskopis hepar merpati:

Dari pembesaran kecil sebuah sayatan dari sepotong hepar, nampak sebagai kelompok lobuli yang secara kasar berisi enam, tiap – tiap lobules dibungkus oleh jaringan ikat dan pada sudut – sudut tertentu membentuk pulau pulau yang jelas juga mengandung pembuluh pembuluh darah dan duktus. Pulau – pulau tersebut adalah kanalis portarum. Pada sisi yang lurus dari lobulus, kadang dapat terlihat pembuluh – pembuluh yaitu vena interlobulares. Susunan jaringan ikat yang mengitari lobulus lebih tipis, hingga kurang jelas. Jaringan lobulus terdiri atas tali – tali radiar dari sel – sel beralternasi dengan sinusoid – sinusoid. Sinusoid – sinusoid berkonvergensi ke pembuluh di sentrum lobulus (vena sentralis).

Gambar preparat miksoskopis hati merpati

Beberapa kesukaran pada saat pemotongan sediaan parafin antara lain; pitatidak terbentuk, hal ini kemungkinan karena pisau yang tumpul; pita melengkungatau bengkok, hal ini kemungkinan karena tepi pisaunya yang tidak rata; sayatantertekan, mengerut, atau berdempet, hal ini kemungkinan karena sudut pisau yangterlalu kecil dan mata pisau yang terlapis dengan sisa parafin; sayatan remuk dancenderung lepas dari parafin, hal ini kemungkinan karena proses dehidrasi danclering yang tidak sempurna; pita belah; sayatan terangkat dari pisau saat blok  parafin naik; dan permukaan sayatan yang bergelombang.

Tahap – Tahap Pembuatan Blok Parafin

Metode parafin adalah suatu metode pembuatan preparat dengan melakukan penanaman jaringan di dalam blok parafin untuk menghasilkan preparat jaringandengan tebal irisan kurang lebih mencapai 6 mikron-8 mikron. Metode ini memilikiirisan yang lebih tipis daripada menggunakan metode beku atau metode seloidinyang tebal irisannya kurang lebih mencapai 10 mikron. Preparat parafin inidilakukan penyelubungan karena jaringan merupakan bahan yang lunak.(Tjiptrosoepomo, 1993).Langkah-langkah penting dalam metode ini antara lain fiksasi, pencucian, dehidrasi, penjernihan, embedding, penyayatan (section), penempelan, pewarnaan, dan penutupan. (Botanika 2008).

KESIMPULAN

Kesimpulan yang dapat diperoleh dari hasil percobaan yang telah dilakukan yaitu metode parafin merupakan suatu cara pembuatan preparat yang menggunakan parafin sebagai media penanamannya. Pembuatan preparat pada metode parafin ini terdiri dari beberapa tahap yaitu narcose (pembiusan), sectio (pemotongan), labelling, fiksasi, washing (pencucian), dehidrasi, clearing (penjernihan), infiltrasi, embedding, sectioning (pengirisan), affixing, staining (pewarnaan), mounting (penutupan), dan labelling (pelabelan).

Kebaikan-kebaikan metoda ini adalah irisan yang dihasilkan jauh lebih tipis dari pada menggunakan metoda beku atau metoda seloidin. Dengan metoda beku, tebal irisan rata-rata diatas 10 mikron, tapi dengan metode paraffin tebal irisan dapat mencapai rata-rata 6 mikron. Irisan-irisan yang bersifat seri dapat dikerjakan dengan mudah bila menggunakan metode ini. Prosedurnya jauh lebih cepat dibandingkan dengan metode seloidin. Namun metode paraffin juga memiliki kelemahan yaitu jaringan menjadi keras, mengerut dan mudah patah. Jaringan-jaringan yang besar tidak dapat dikerjakaan, bila menggunakan metode ini. Sebagian besar enzim-enzim akan larut dengan medode ini.

Beberapa kesukaran pada saat pemotongan sediaan parafin antara lain; pitatidak terbentuk, hal ini kemungkinan karena pisau yang tumpul; pita melengkungatau bengkok, hal ini kemungkinan karena tepi pisaunya yang tidak rata; sayatantertekan, mengerut, atau berdempet, hal ini kemungkinan karena sudut pisau yangterlalu kecil dan mata pisau yang terlapis dengan sisa parafin; sayatan remuk dancenderung lepas dari parafin, hal ini kemungkinan karena proses dehidrasi danclering yang tidak sempurna; pita belah; sayatan terangkat dari pisau saat blok  parafin naik; dan permukaan sayatan yang bergelombang.

DAFTAR PUSTAKA

Amanda, 2007, Membuat Preparat Melintang Dengan Metode Parafin,http://monocotil.blogspot.com , Diakses pada tanggal 20 September 2011.

Botanika, 2008, Fixation, Embedding, Sectioning, http://botanika.biologija.org , Diakses pada tanggal 20 September 2011.

Hugo. 2008. Mayer Albumin. http://www.hardydiagnostics.com/catalog/hugo/MayersA Plbumin.htm. Tanggal akses 7 November 2008

Lianury, Robby N, 2000, Histologi, Universitas Hasanuddin Press, Makassar.

Praptomo, 2010, Pembuatan Preparat Parafin Jaringan Tumbuhan (Mikroteknik), http://www.nagkoyo.com , Diakses pada tanggal 20 September 2011.

Rina, 2011, Mikroteknik, http://rinaningtyas.blogspot.com , Diakses pada tanggal 20 September 2011.

Santoso, H. B. 2002. Bahan Kuliah Teknik Laboratorium. Universitas Lambung Mangkurat, Banjarbaru

Setjo, Susetyoadi, 2004, Anatomi Tumbuhan, Universitas Negeri Malang, Malang.

Tjiptrosoepomo, G. 1993. Taksonomi Tumbuhan Spermatophyta.

LAMPIRAN

Laporan sementara praktikum parafin

Surakarta, 7 Juni 2012

Mengetahui,

Asisten

( )

Praktikan,

Istiqomah Wahyu Pradana

K4309045

 

 

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *