Contoh Makalah Larutan Stock, Media Kultur dan Sterilisasi Alat

Posted on

Berikut Kami sajikan contoh Makalah tentang Pembuatan Larutan Stock, MEdia Kultur dan Sterilisasi alat yang dapat di download

PEMBUATAN LARUTAN STOCK, MEDIA KULTUR DAN STERILISASI ALAT

  1. Pendahuluan
  2. Latar Belakang

Dalam teknik kultur jaringan yang paling penting dilakukan adalah sterilisasi alat dan pembuatan media kultur. Sterilisasi adalah usaha membebaskan bahan dan alat dari mikroorganisme. Media kultur yang tepat yaitu yang mengandung nutrisi atau zat-zat yang diperlukan oleh eksplan untuk petumbuhan dan perkembangan jaringan.

Makhluk hidup memerlukan nutrisi untuk tumbuh dan berkembang .Nutrisi didapat dari media yang ditempati.Tanaman yang dikembangbiakkan dengan teknik kultur jaringan memerlukan media yang dibuat sesuai dengan kebutuhan yang diperlukan tanaman. Kultur jaringan merupakan suatu cara budidaya tanaman dalam jumlah banyak dalam kondisi yang aseptis secara in-vitro tanpa memerlukan waktu yang lama (Matatula. 2003: 203). Ciri teknik ini adalah kondisi kultur yang aseptis, penggunaan media kultur buatan dengan kandungan nutrisi lengkap, dan kondisi lingkungan kultur yang sesuai. Lingkungan yang sesuai dapat dipenuhi dengan menentukan media tumbuh yang sesuai dan penempatan pada kondisi yang terkendali berkaitan dengan intensitas dan periodisitas, cahaya, temperatur, dan kelembaban serta keharusan sterilisasi.

Media kultur yang tepat yaitu yang mengandung nutrisi atau zat-zat yang diperlukan oleh eksplan untuk petumbuhan dan perkembangan jaringan.Media kultur jaringan dikatakan baik apabila takaran dan komposisinya sudah sesuai. Bahan-bahan kimia yang merupakan komponen media terkadang hanya dibutuhkan dalam jumlah yang relatif kecil sehingga bahan-bahan tersebut disediakan dalam bentuk larutan stok. Larutan stok adalah larutan bahan-bahan komponen media yang besarnya telah dikalikan menjadi beberapa konsentrasi. Fungsi larutan stok dalam pembuatan media adalah untuk memudahkan penimbangan dan menghindari kesalahan penimbangan bahan-bahan yang diperlukan dalam jumlah yang relatif kecil.

Sterilisasi dimaksudkan untuk menciptakan serta memelihara kondisi aseptik. Seperti yang kita ketahui bahwa sumber kontaminan yang terdiri dari jamur dan bakteri berukuran sangat kecil. Baik media tumbuh maupun eksplan yang akan ditanam harus dibebaskan dari sumber kontaminan yang menyebabkan kontaminasi.

Pada dasarnya, peralatan yang digunakan dalam teknik kultur jaringan harus bersih dan steril. Peralatan yang tidak steril mengakibatkan tanaman yang ditanam pada kultur jaringan menjadi terkontaminasi sehingga tidak dapat tumbuh kembang dan menghambat proses pertumbuhan pada tanaman karena yang disebabkan oleh jamur dan bakteri.

Unsur-unsur yang dibutuhkan pada media kultur antara lain seperti aquadest, larutan stok terdiri atas hara mikro dan hara makro, vitamin, zat pengatur tumbuh (ZPT), agar-agar, gula serta NaOH dan HCL.

Dalam metode kultur jaringan diperlukan lingkungan yang steril. Suatu contoh yang paling baik adalah ruang bedah dirumah sakit. Ada beberapa metode sterilisasi alat dan bahan tanaman. Sterilisasi dapat dilakukan dengan beberapa cara yaitu dengan pemanasna kering, pemanasan basah, penyaringan atau secara kimiawi.

Pemanasan kering adalah cara sterilisasi dengan suhu tinggi menggunakan oven. Cara ini hanya digunakan untuk alat-alat gelas, peralatan logam, atau bahan lain yang tidak mudah pecah karena suhu tinggi. Bahan yang mengandung kapas, kertas, atau plastik tidak dapat disterilkan. Pisau potong dan scalpel jangan disterilkan dengan cara ini karena akan menyebabkan tumpul.

Pemanasan basah adalah cara sterilisasi menggunakan autoklaf. Alat tanam seperti pinset, gunting dapat disterilkan dengan cara ini. khusus untuk pisau sterilisasi dianjurkan dengan cara pencelupan dalam alkohol atau larutan kaporit.

Alat-alat yang perlu disterilkan sebelum penanaman adalah pinset, gunting, gagang scalpel, kertas saring, petridish, botol kosong, jarum dan pipet. Kertas aluminium umum digunakan sebagai pembungkus, walaupun tidak dianjurkan karena uap tidak dapat masuk kedalam bungkusan. Suhu sterilisasi adalah 121C pada tekanana 17,5 psi selama 1 jam. Penghitungan waktu sterilisasi dimulai setelah tekanan yang diinginkan tercapai. Akuades juga perlu disterilkan dalam autoklaf dengan waktu, suhu dan tekanan sama seperti sterilisasi alat.

Media kultur yang tidak mengandung bahan-bahan yang tidak tahan panas, dapat disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121C tekanan 17,5 psi selama 20-30 menit, tergantung volume wadah dan media. Setelah waktu sterilisai dicapai tekanan dibiarkan turun perlahan sampai mencapai tekanan atmosfer. Penurunan tekanan secara mendadak akan menyebabkan media dan akuades mendidih dan meluap. Memperpanjang waktu sterilisasi harus dihindarkan karena dapat menyebabkan terurainya bahan kimia yang ada dalam medium. Setelah bahan kertas disterilkan dengan autoklaf bahn harus diletakkan dalam oven pengering sebentar untuk menguapkan air yang mengembun. Hal lain yang harus diperhatikan adalah ketersediaan aiar dalam autoklaf. Setiap kali pemakaian autoklaf harus menambah air dan dianjurkan menggunakan akuades.

Sterilisasi secara kimiawi digunakan untuk mensterilkan permukaan tempat kerja biasanya menggunakan etanol atau isopropanol 70%. Etanol dengan konsentrasi lebih tinggi (80%) secara berkala digunakan untuk mensterilkan peralatan.

Sterilisasi permukaan bahan tanaman dapat dilakukan dengan mencelup dalam larutan natrium hipoklorit (NaOCl) atau kalsium hipoklorit (Ca(Ocl)2). Pada umumnya laboratorium menggunakan larutan pembersih rumah tangga seperti korox atau bayclin.

Berdasarkan uraian di atas, dapat diketahui bahwa keberhasilan dari kultur jaringan sangat bergantung dari ketepatan konsentrasi nutrisi yang berada di dalam media kultu dan kondisi aseptis. Ketepatan konsentrasi ini menyangkut pada ketersediaan nutrisi bagi eksplan tanaman. Kelebihan nutrisi dari tanaman akan menyebabkan tanaman mengalami keracunan unsur hara. Oleh karena itu, pembuatan dan sterilisasi media dianggap penting untuk diketahui sebagai pennunjang kebutuhan informasi akan kultur jaringan.

  1. Tujuan Praktikum
  2. Mengetahui langkah-langkah dalam pembuatan larutan stock
  3. Mengetahui langkah-langkah dalam pembuatan media kultur jaringan
  4. Mengetahui prosedur sterilisasi alat – alat penanaman
  5. Tinjauan Pustaka

Media adalah tempat pertumbuhan eksplan yang mengandung segala macam nutrisi untuk mencukupi kebutuhan tanaman yang akan dikulturkan agar dapat berkembang dengan baik. Pembuatan media pada prinsipnya dilakukan dengan melarutkan semua komponen media dalam air sesuai dengan konsentrasinya pada formulasi yang diinginkan. Biasanya, penimbangan komponen media tidak dapat dilakukan satu per satu karena terdapat komponen yang hanya dibutuhkan dalam jumlah yang relatif kecil. Masalah tersebut dapat diatasi dengan pembuatan larutan stok. Larutan stok adalah larutan berisi satu atau lebih komponen media yang konsentrasinya lebih besar dari konsentrasi komponen tersebut dalam formulasi media yang akan dibuat (Hemawan dan Na”em, 2006).

Larutan stok ini merupakan sekelompok larutan media kimia berkonsentrasi yang disiapkan di awal dan digunakan untuk membuat beberapa kumpulan media. Larutan stok dibuat dalam satuan jumlah liter pada 10 sampai 100 kali konsentrasi yang dibutuhkan pada formula akhir. Pembuatan larutan stok mengurangi resiko perbedaan berat kimiawi yang besar. Fungsi larutan stok adalah untuk mengurangi ketidakakuratan penimbangan sehingga dapat berdampak buruk bagi kultur jaringan. (Lydiane Kyte & John Kleyn. 1996: 76). Hal tersebut serupa dengan pendapat Endang Yuniastuti (2008: 6-7) yaitu larutan stok berfungsi untuk memudahkan penimbangan dan menghindari kesalahan penimbangan bahan-bahan yang diperlukan dalam jumlah yang relatif kecil. Beberapa komposisi akan mengendap jika dicampurkan bersama dalam konsentrasi yang sama. Jadi untuk menghindari terjadinya pengendapan maka sebelum menambahkan bahan kimia apapun pada pembuatan larutan stok, harus ada air dalam labu, sehingga pengendapan sulit untuk terjadi (Bernice M. Martin. 1994: 39).

Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media kultur yang baik seharusnya menyediakan unsur hara baik makro maupun mikro, sumber vitamin dan asam amino, sumber karbohidrat, zat pengatur tumbuh, senyawa organik sebagai tambahan seperti air kelapa, ekstrak buah dll, bahan pemadat: agar-agar dan gelrite dan juga menyediakan arang aktif untuk kasus tertentu untuk tanaman. Zat pengatur tumbuh (hormon) yang ditambahkan juga bervariasi, baik jenisnya maupun jumlahnya, tergantung dengan tujuan dari kultur jaringan yang dilakukan (Ritonga. 2007: 1). Media kultur jaringan yang baik, selain dapat menyediakan semua keperluan tanaman juga harus steril dari kontaminasi.

Berdasarkan komposisi media kultur yang telah diformulasikan untuk mengoptimalkan pertumbuhan dan perkembangan eksplan, media dapat dibedakan menjadi beberapa macam seperti: komposisi Knudson C (1946), Heller (1953), Nitsch dan Nitsch (1972), Gamborg dkk B5 (1976), Linsmaier dan Skoog-LS (1965), Murashige dan Skoog MS (1962) serta woody plant medium-WPM (Lloyd dan Mc Known, 1980).

Merujuk pendapat Endang Yuniastuti (2009: 10), komponen media kultur yang lengkap harus terdiri dari komponen berikut: (1) air distilata (akuades) atau air bebas ion sebagai pelarut atau solven, (2) hara-hara makro dan mikro, (3) gula (umumnya sukrosa) sebagai sumber energi, (4) vitamin, asam amino dan bahan organic lain, (5) zat pengatur tumbuh, (6) suplemen berupa bahan-bahan alami, jika diperlukan dan (7) agar-agar atau gelrite sebagai pemadat media.

Ritonga (2007: 1-2) berpendapat bahwa senua komponen media memiliki fungsi tertentu dalam rangka mendukung pertumbuhan eksplan. Unsur hara makro dan mikro diberikan dalam bentuk garam-garam anorganik sesuai dengan jenis tanaman yang akan dikulturkan. Vitamin yang banyak digunakan adalah vitamin B12 (thiamin), Nicotinic Acid, vitamin B6 (pyridoxine), dan vitamin E atau C yang digunakan sebagai antioksidan. Asam amino dipakai sebagai sumber N organik, yang biasa digunakan adalah glycine, asparagin, glutanin, alanin, dan threonin.

Zat Pengatur Tumbuh (ZPT) sangat penting dalam pembutan media kultur jaringan. Zat pengatur tumbuh adalah suatu persenyawaan organik yang dalam jumlah sedikit (1 mM) dapat merangsang, menghambat atau mengubah pola pertumbuhan dan perkembangan tanaman. Dalam kultur jaringan ZPT yang penting adalah sitokinin (Kinetin, BA, Zeatin, 2iP, Thidiazuron), auksin (IAA, NAA, IBA, 2.4-D, 2.4.5-T, Dicamba, Picloram). Kedua ZPT ini mempunyai fungsi masing-masing yang berbeda, sitokinin mempengaruhi pembelahan sel serta pembentukan organ seperti pucuk dan pembentukan embrio somatik. Auksin dipakai untuk menginduksi pembentukkan sel dan akar. Kombinasi antara auksin dan sitokinin berfungsi untuk menginduksi pertumbuhan kalus. Selain auksin dan sitokinin digunakan juga giberelin (menginduksi pemanjangan tunas dan perkecambahan embrio, dan menghambat pengakaran) dan retardan (untuk menghambat pertumbuhan tunas) seperti pachlobutrazol. Senyawa organik sering ditambahkan ke dalam media sebagai sumber pembentuk asam amino dan vitamin. Senyawa organik yang sering ditambahkan adalah air kelapa, ekstrak ragi, ekstrak buah, dan casein hydrolisat. Sebagai sumber energi ditambahkan dari senyawa-senyawa yang merupakan sumber karbohidrat, seperti sukrosa (paling baik pada tanaman umumnya), glukosa, fruktosa, dam maltosa. Penambahan arang aktif berfungsi untuk mengarbsorbsi senyawa-senyawa fenolik dan untuk merangsang pertumbuhan akar.

Selain ditambahkan oleh senyawa-senyawa tersebut, media yang baik harus selalu berada dalam PH yang optimal yaitu 5,5-5,8. selain itu, harus dibuat dalam tempat yang steril. Autoklaf sering dipakai untuk sterilisasi dalam pembuatan media kultur jaringan ((Ritonga. 2007: 2)

Husni (1997) menyebutkan bahwa untuk perbanyakan klonal, pada umumnya dipakai media dasar Murashige dan Skoog (MS). Media tersebut mempunyai konsentrasi garam anorganik yang tinggi dibandingkan medium lainnya terutama ion NH4 dan NO3. Banyak penelitian yang menyatakan bahwa pengurangan komponen senyawa penyusun media berpengaruh baik terhadap pertumbuhan biakan tanaman dalam botol.

Menarik Lainnya  Sejarah dan Perkembangan Biokimia

Menurut Marlina (2004: 4) komposisi media Murashige and Skoog (Media MS) dapat dilihat pada tabel 1 berikut ini:

Tabel 1. Komposisi media Murashige and Skoog (MS)

KomponenKomposisi
Unsur makro
NH4NO31.650
KNO31.900
CaCl2.2H2O440
MgSO4.2H2O370
KH2PO4
Unsur mikro
KI0,830
H3BO36,200
MnSO4.4H2O22,300
ZnSO4.7H2O8,600
Na2SO4.2H2O0,250
CuSO4.5H2O0,025
CoCl2.6H2O0,025
Na2EDTA37,200
FeSO4.7H2O27,800
Vitamin dan Asam amino
Thiamin1,000
Asam nikotinat0,500
Pyridoxin HCl0,500
Glycine2,000
Asam sistein50,000
Asam pantotenat3,000
Myo-inositol100,000
Sukrosa30,000
Agar70,000

Sterilisasi merupakan suatu proses untuk mematikan semua organisme yang terdapat pada atau di dalam suatu benda. Sterilisasi basah dapat digunakan untuk mensterilkan bahan apa saja yang dapat tembus uap air dan tidak rusak bila dipanaskan dengan suhu yang berkisar antara 110-121C. Sterilisasi yang umum dilakukan dapat berupa:

  1. Sterilisasi secara fisik (pemanasan, penggunaan sinar gelombang pendek yang dapat dilakukan selama senyawa kimia yang akan disterilkan tidak akan berubah atau terurai akibat temperatur atau tekanan tinggi). Dengan udara panas, dipergunakan alat “bejana/ruang panas” (oven dengan temperatur 170o – 180oC dan waktu yang digunakan adalah 2 jam yang umumnya untuk peralatan gelas).
  2. Sterilisasi secara kimia (misalnya dengan penggunaan disinfektan, larutan alkohol, larutan formalin).
  3. Sterilisasi secara mekanik, digunakan untuk beberapa bahan yang akibat pemanasan tinggi atau tekanan tinggi akan mengalami perubahan, misalnya adalah dengan saringan/filter. Sistem kerja filter, seperti pada saringan lain adalah melakukan seleksi terhadap partikel-partikel yang lewat (dalam hal ini adalah mikroba)

(http://elearning.unram.ac.id/KulJar/BAB%20IV%20STERILISASI/IV2%20Sterilisasi %20Alat.ht)

Alat sterilisasi baik media maupun peralatan yang digunakan untuk proses isolasi dan penanaman eksplan yang sering digunakan adalah autoklaf. Tipe autoklaf yang dapat digunakan untuk sterilisasi ada bermacam-macam, mulai dari yang sederhana sampai digital (terprogram). Autoklaf yang sederhana menggunakan sumber uap dari pemanasan air yang ditambahkan ke dalam autoklaf. Pemanasan air dapat menggunakan kompor atau api Bunsen. Dengan autoklaf sederhana ini, tekanan dan temperatur diatur dengan jumlah panas dari api. Sterilisasi dengan autoklaf adalah salah satu metode sterilisasi dengan uap air dibawah tekanan. Kapas penyumbat, kasa, perlatan laboratorium, plastik penutup, peralatan gelas, penyaring, air, dan media nutrisi dapat disterilisasi dengan autoklaf. Hampir semua mikroba mati bial terkena uap yang sangat panas dari autoklaf selama 10-15 menit/ semua obyek hendaknya disterilisasi pada suhu 121ºC dan tekanan 15 Psi selama 15-20 menit (Torres, 1989).

Bagian-bagian autoklaf :

1. Panci luar.

2.  Panci dalam tempat meletakkan botol dengan alur tempat saluran uap.

3.  Tutup beserta penunjuk tekanan dan saluran uap.

4.   Katup pengeluaran uap.

5.   Pengunci atau klem.

Dalam sterilisasi aquadest, lebih efektif bila digunakan wadah yang mempunyai volume antara 300 – 500 ml. Isi wadah tersebut sampai 80% volume, dan tutup dengan kertas, serta kencangkan dengan karet gelang.

Media disterilkan dalam autoklaf. Untuk aquadest sebaiknya dimasukkan dalam wadah kecil misalnya erlemeyer 250 ml dengan isi maksimum 100 ml, agar sterilisasi lebih efektif. Waktu sterilisasi sama dengan waktu untuk sterilisasi alat-alat waktu 30 menit pada tekanan 15 psi. atau 1 atm.

Untuk media kultur yang tidak mengandung bahan-bahan yang Heat-labile, sterilisasi dilakukan dengan autoklaf pada temperatur 121oC, tekanan antara 15 psi atau 1 atm dengan waktu antara 20-25 menit tergantung dari volume wadah dan volume media. Untuk 15-50 ml media dalam tabung reaksi atau botol kecil berukuran 50-100 ml, sterilisasi dilakukan pada tekanan 15 psi dengan waktu 20 menit. Untuk 20 botol volume 1 liter  membutuhkan waktu yang lebih lama yaitu 34 menit, 10 botol volume 2 liter memerlukan waktu 37 menit, 5 botol 4 liter waktu yang digunakan 52 menit. Dengan waktu yang lebih lama. Dalam sterilisasi aquadest dan media, setelah waktu sterilisasi yang diinginkan sudah tercapai, autoklaf tidak boleh diturunkan tekanannya secara mendadak. Bila tekanan diturunkan mendadak, cairan didalamnya mendidih dan meluap (bubbled up).

Untuk bahan-bahan yang heat-labile dalam bentuk larutan, sterilisasi dilakukan dengan menyaring larutan melalui filter yang mempunyai ukuran pori 0.20-0.22 um. Diameter filter yang bermacam-macam tergantung dari volume larutan yang ingin disterilkan. Untuk volume larutan 10 ml, dipergunakan filter yang dipasang di ujung jarum suntik. Bahan yang heat labile antara lain : GA3, Thiamin-HCL, Ca-panthothenate, Antibiotik: carbenocilin.  

Botol-botol/tabung reaksi/erlenmeyer yang dipergunakan sebagai wadah, biasanya disterilkan dalam oven. Botol-botol yang sudah dicuci bersih, dimasukkan ke dalam oven dan dipanaskan selama 4 jam pada temperatur 160o C. Setelah disterilkan dapat langsung digunakan. Bila botol akan disimpan untuk beberapa lama, maka sewaktu sterilisasi, mulut botol harus ditutup dengan alumunium foil.

(http://www.iptek.net).

Sebagai syarat mutlak suksesnya kultur jaringan tanaman, biasanya sterilisasi dilakukan dengan menggunakan autoklaf. Bahkan autoklaf juga dapat digunakan untuk sterilisasi media tumbuh kultur jaringan. Tipe autoklaf yang dapat digunakan untuk sterilisasi sangatlah beragam macamnya, mulai dari yang sederhana sampai digital (terprogram) (Gunawan, 1988).

Autoklaf yang sederhana menggunakan sumber uap dari pemanasan air yang ditambahkan ke dalam autoklaf. Pemanasan air dapat menggunakan kompor atau api Bunsen. Dengan autoklaf sederhana ini, tekanan dan temperatur diatur dengan jumlah panas dari api. Kelemahan dari autoklaf ini adalah bahwa perlu adanya penjagaan dan pengaturan panas secara manual dan terkontrol, selama masa sterilisasi dilakukan. Tetapi autoklaf ini mempunyai keuntungan, yaitu: lebih sederhana sederhana, harga relatif murah, tidak tergantung dari aliran listrik yang sering merupakan problema untuk negara-negara yang sedang berkembang, serta lebih cepat dari autoklaf listrik yang seukuran dan setaraf.

Autoklaf yang lebih komplit menggunakan sumber energi dari listrik. Alatnya dilengkapi dengan timer dan thermostat. Bila pengatur automatis ini berjalan dengan baik. Maka autoklaf dapat dijalankan sambil mengerjakan pekerjaan lain. Kelemahannya adalah bila salah satu pengatur tidak bekerja, maka pekerjaan persiapan media menjadi sia-sia dan kemungkinan menyebabkan kerusakkan total pada autoklaf. Sebagai sumber uap, juga berasal dari air yang ditambahkan ke dalam autoklaf dan didihkan.

Biasanya untuk laboratorium komersial, menurut Gunawan (1988), diperlukan autoklaf dengan kapasitas besar dan sumber uap biasanya dari boiler yang terpisah. Autoklaf ini sangat cepat dan dapat diprogam waktu sterilisasi serta waktu pendinginan. Setelah sterilisasi bahan atau alat selesai, temperatur dan tekanan autoklaf diturunkan secara perlahan-lahan dalam waktu 15-20 menit. Pada autoklaf yang programmable (memiliki program yang dapat diatur), panas ini diatur secara atomatis. Tetapi pada autoklaf yang sederhana hal ini harus diatur secara manual.

  1. Metode Praktikum
  2. Waktu dan Tempat Praktikum

Praktikum acara Pembuatan Larutan Stock, Media Kultur Dan Sterilisasi Alat dilaksanakan pada

Hari/ Tanggal : Kamis, 11 Oktober 2012

Waktu : 18.30 s/d 21.00 WIB

Tempat : Laboratorium Kultur Jaringan Fakultas Pertanian Universitas Sebelas Maret Surakarta

Alat

  1. Peralatan untuk penanaman eksplan, meliputi:
  2. Laminar air flow cabinet (LAFC), lengkap dengan lampu bunsen yang berisi spiritus
  3. Petridish dan botol –botol kultur
  4. peralatan diseksi, pinset besar/kecil, pisau pames dan gunting eksplan

Alat – alat penanaman, yaitu petridish dan peralatan diseksi dibungkus dengan kertas, kemudian disterilisasi di dalam autoklaf pada tekanan 1,5 kg/cm2 selama 45 menit. Setelah disterilisasi, alat – alat tersebut disimpan di dalam oven.

  1. Alat pembuatan media tanam
  2. Timbangan analitik
  3. Botol-botol kultur
  4. Magnetik stirrer
  5. pH meter
  6. Gelas piala
  7. Pipet
  8. Plastik pp 0,3 mm
  9. Karet gelang
  10. Kertas label.

Bahan

Bahan – bahan untuk pembuatan media

  1. Aquadest
  2. Larutan stok, terdiri dari hara makro dan mikro, vitamin serta ZPT (Zat Pengatur Tumbuh)
  3. Agar-agar
  4. Gula
  5. NaOH 1 N dan HCL 1 N

Cara Kerja

Pembuatan Larutan Stok

Bahan-bahan kimia komponen media dibutuhkan dalam jumlah yang relatif kecil, oleh karena itu bahan-bahan tersebut disediakan dalam bentuk larutan yang disebut sebagai larutan stok.

Larutan stok merupakan larutan bahan-bahan komponen media yang besarnya telah dikalikan menjadi beberapa konsentrasi. Sehingga larutan stok ini berfungsi untuk memudahkan penimbangan dan menghindari kesalahan penimbangan bahan-bahan yang diperlukan dalam jumlah yang relatif kecil.

Langkah-langkah pembuatan larutan stok, meliputi :

  1. Larutan stok media
    1. Menimbang bahan-bahan kimia yang telah dikalikan menjadi beberapa kali konsentrasi, misalnya untuk unsur hara makro dikalikan 20 dan unsur hara mikro dikalikan 100 kali konsentrasi.
    2. Melarutkan bahan-bahan kimia tersebut ke dalam aquadest dengan volume tertentu, misalnya 500 ml.
    3. Memasukkan masing-masing larutan ke dalam botol dan menyimpannya ke dalam refrigerator.
  2. Larutan stok zat pengatur tumbuh

Zat pengatur tumbuh hanya diperlukan dalam jumlah sedikit sekali. Biasanya zat pengatur tumbuh ini dibuat dengan kepekatan 1-10 mg/ml. cara membuat larutan stok masing-masing ZPT adalah sebagai berikut :

  1. Menghitung kebutuhan bahan BAP 100 ppm sebanyak 300 ml adalah sebagai berikut :

100 ppm = 100 mg/l

= 30 mg/0,3 l

= 30 mg/300 ml

  1. Menghitung kebutuhan bahan IBA 100 ppm sebanyak 100 ml adalah sebagai berikut :

100 ppm = 100 mg/l

= 10 mg/ 0,1 l

= 10 mg/100 ml

  1. Melarutkan bahan dengan alkohol atau NaOH 1 N kemudian ditambah dengan aquadest sampai 300 ml untuk BAP dan 100 ml untuk IBA.
  2. Memasukkan masing-masing larutan tersebut ke dalam botol dan menyimpannya ke dalam refrigerator.
Pembuatan Media Kultur

Media kultur merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan perbanyakan tanaman secara kultur jaringan. Berbagai komposisi media kultur telah diformulasikan untuk mengoptimalkan pertumbuhan dan perkembangan tanaman yang dikulturkan. Contohnya komposisi Knudson C (1946), Heller (1953), Nitsch dan Nitsch (1972), Gamborg dkk. B5 (1976), Linsmaier dan Skoog-LS (1965), Murashige dan Skoog-MS (1962) serta woody plant medium-WPM (Lloyd dan McCown, 1980). Komponen media kultur yang lengkap sebagai berikut :

        1. Air distilata (aquadest) atau air bebas ion sebagai pelarut atau solven.
        2. Hara-hara makro dan mikro
        3. Gula (umumnya sukrosa) sebagai sumber energi
        4. Vitamin, asam amino dan bahan organik lain
        5. Zat pengatur tumbuh
        6. Suplemen berupa bahan-bahan alami, jika diperlukan
        7. Agar-agar atau gelrite sebagai pemadat media.

Langkah-langkah pembuatan media (1 liter) adalah sebagai berikut :

          1. Mengambil masing-masing larutan stok sesuai dengan ukuran yang telah ditentukan dan memasukkannya ke dalam gelas piala.
          2. Mengambil larutan stok ZPT sesuai dengan perlakuan, misalnya :
  1. Untuk membuat media 1L dengan konsentrasi BAP 2 ppm, maka volume larutan stock yang diambil adalah:

V1 X M1 = V2 X M2

V1 X 100 ppm = 1000m ml X 2 ppm

V1 = 20 ml/L

  1. Untuk membuat media 1 L dengan konsentrasi IBA 0,5 ppm, maka volume larutan stok yang diambil adalah:

V1 X M1 = V2 X M2

V1 X 100 ppm = 1000 ml X 0,5 ppm

V1 = 5 ml/L

Ket: V1 = volume larutan stok yang diambil

Menarik Lainnya  Contoh Laporan Praktikum Embriologi Hewan - (Tipe-tipe Telur)

M1 = dosis larutan stok yang tersedia

V2 = volume media yang akan dibuat

M2 = dosis media yang akan dibuat

          1. Menambah aquadest sampai 1000 ml.
          2. Menambah gula sebanyak 30 gr.
          3. Mengatur pH dalam kisaran 5,8-6,3 dengan menambahkan beberapa tetes NaOH untuk menaikkan pH atau HCL untuk menurunkan pH. Pada saat pengukuran pH, larutan media diaduk dengan magnetik stirer.
          4. Menambahkan agar-agar 8 gr kemudian dididihkan
          5. Menuangkan larutan media ke dalam botol-botol kultur kurang lebih 25 ml tiap botol
          6. Menutup botol berisi larutan media dengan plastik
          7. Memasukkan botol-botol berisi media ke dalam autoklaf untuk proses sterilisasi pada tekanan 1,5 kg/cm2 selama 45 menit
          8. Menyimpan media pada rak penyimpan media yang bertujuan untuk mengantisipasi ada tidaknya kontaminasi pada media sehingga dapat dicegah penggunaan media yang telah terkontaminasi pada saat penanaman.
      1. Media Penanaman

Dalam praktikum ini, media yang digunakan adalah media Murashige dan Skoog (MS) yang dimodifikasi dengan penambahan ZPT BAP 2 ppm dan IAA 0,5 ppm. Media kultur tersebut digunakan untuk penanaman 4 macam eksplan dengan masing-masing eksplan diulang sebanyak 2 kali untuk setiap mahasiswa / praktikan.

  1. Sterilisasi Alat dan Media Kultur

Sterilisasi alat dan media kultur jaringan dilakukan secara bersamaan menggunakan autoklaf. Langkah-langkah sterilisasi alat dan media kultur :

  1. Membungkus alat-alat kultur seperti petridish, pisau scalpel dan pinset dengan kertas koran.
  2. Memasukkan botol-botol berisi media dan alat-alat kultur yang telah dibungkus kertas koran ke dalam autoklaf untuk proses sterilisasi pada suhu 121° C, tekanan 1,5 kg/cm2 selama 45 menit.
  3. Menyimpan alat-alat kultur dalam oven.
  4. Menyimpan media pada rak penyimpan media yang bertujuan untuk mengantisipasi ada tidaknya kontaminasi pada media sehingga dapat dicegah penggunaan media yang telah terkontaminasi pada saat penanaman.
  5. Hasil Pengamatan dan Pembahasan
  6. Hasil Pengamatan

Gambar 1. 1 Media kultur jaringan

  1. Pembahasan

Media adalah tempat tumbuh eksplan yang di dalamnya mengandung banyak nutrisi untuk menunjang kehidupan dan pertumbuhan eksplan. Media merupakan faktor penentu keberhasilan dalam perbanyakan tanaman dengan kultur jaringan (Matatula, 2003: 203). Ciri-ciri media yang baik untuk kultur jaringan adalah media padat dan tidak lembek, PH sesuai untuk kehidupan tanaman dan mengandung Zat Pengatur Tumbuh (ZPT) yang mendukung kehidupan tanaman.

Komposisi media yang digunakan dalam kultur jaringan tergantung pada jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam mineral, vitamin, dan hormone. Selain itu perlu ditambahkan bahan tambahan seperti agar, gula, dan lain-lain. Zat pengatur tumbuh yang ditambahkan juga bervariasi baik jenis maupun jumlahnya, tergantung dengan kultur jaringan yang akan dilakukan.Sesuai pendapat Endang Yuniarti (2009: 10), komposisi utama media tanam kultur jaringan terdiri dari komponen berikut: (1) air distilata (akuades) atau air bebas ion sebagai pelarut atau solven, (2) hara-hara makro dan mikro, (3) gula (umumnya sukrosa) sebagai sumber energi, (4) vitamin, asam amino dan bahan organic lain, (5) zat pengatur tumbuh, (6) suplemen berupa bahan-bahan alami, jika diperlukan dan (7) agar-agar atau gelrite sebagai pemadat media. Perbedaan komposisi media dapat mengakibatkan perbedaan pertumbuhan dan perkembangan eksplan yang ditumbuhkan secara in vitro (Marlina, 2004: 4).

Praktikum kali ini menggunakan media Murashige Skoog (MS) yang sebelumnya telah dibuat larutan stok. Larutan stok merupakan larutan pekat senyawa-senyawa kimia penyusun media yang memudahkan penimbangan sehingga jumlah atau volume masing-masing komponen media yang terbentuk dalam jumlah tepat. Larutan stok dibuat dalam konsentrasi pekat 10 atau 100 kali konsentrasi akhir yang dibutuhkan untuk media. Pada praktikum kali ini, untuk hara makro kecuali CaCl2.2H2O dibuat larutan stoknya, untuk CaCl2.2H2O dibuat larutan stock tersendiri karena apabila di campur zat ini akan mengendap. Media Murashige skoog (MS) terdiri dari komponen-komponen berikut:

  1. Garam-garam anorganik terdiri dari makronutrient (C, H, O, N, S, P, K, Ca, Mg). N didapatkan dari NO3 atau NH4+ atau asam amino. Mg dan S didapatkan dari MgSO4.7H2O. P didapat dari NaH2PO4.H2O dan KH2PO4. K didapat dari KCl, K2NO3 atau KH2PO4. K didapatkan dari KCl, K2NO3 atau KH2PO4. Ca didapatkan dari CaCl2.2H2O atau Ca(NO3)2. Dan Cl dari KCl atau CaCl2. Selain itu dibutuhkan juga mikronutrient yang terdiri dari Cu, Zn, FeEDTA, B, Mo, Co, dan I.
  2. Sumber karbon yang digunakan adalah sukrosa, sebagai sumber energi. Konsentrasi sukrosa yang digunakan adalah 20.000- 45.000 mg/L.
  3. Asam amino merupakan sumber N organik. Asam amino yang sering digunakan adalah glutamine, asparagin, sistein, dan glisin.
  4. Vitamin berfungsi sebagai katalisator dalam sistem enzim dan diperlukan dalam jumlah kecil. Vitamin yang dibutuhkan pada sebagian besar kultur jaringan tumbuhan adalah thiamin, yang diberikan dalam bentuk Thiamin-HCl. Vitamin lain yang biasa digunakan adalah asam nikotinat dan piridoksin HCl (vitamin B6).

Dalam media juga perlu diperhatikan tingkat keasamannya ( pH ). Sel-sel tanaman yang dikembangkan dengan teknik kultur jaringan mempunyai toleransi pH yang relatif sempit dengan titik optimal antara pH 5,0 – 6,0 (Daisy, 1994). Dalam pembuatan media pH-nya harus dijaga pada pH 5,8 sampai 6,3 dengan penambahan KOH atau NaOH untuk menaikkan pH dan dan HCl untuk menurunkan pH. pH harus dijaga pada 5,8 sampai 6,3 sebab pada kawasan pH ini merupakan pH yang optimum untuk penyerapan hara oleh tanaman. Pada praktikum kali ini dilakukan penambahan HCl tetes karena campuran media yang didapat terlalu basa. Namun harus juga dihindari penambahan HCl dan NaOH secara berlebihan karena akan mengurangi tingkat keberhasilan pembuatan media.

Dari hasil pengamatan, media yang dibuat oleh kelompok kami berhasil. Ini karena setelah disterilisasi dan diletakkan di dalam rak kultur, media sudah benar-benar memadat, tidak cair lagi dan tidak lembek. Permukaan media juga rata dan bagus tidak bergelombang sama sekali.

Keberhasilan dan kegagalan dalam membuat media dipengaruhi oleh banyak hal meliputi :

  1. Pengukuran komponen pembuatan media yang ditambahkan kurang tepat.
  2. Perataan komponen media dengan menggunakan magnetic stirer kurang lama sehingga media yang di dapat belum benar-benar homogen.
  3. Pemasakan media yang kurang matang sehingga komponen yang ditambahkan terutama agar-agar belum tercampur dengan baik,
  4. Pengambilan media dari autoklaf ketika sterilisasi terlalu cepat sehingga media banyak yang gagal ditandai dengan penutup media yang rusak ketika pengambilan.

Sterilisasi alat dan media

Syarat utama keberhasilan kultur in vitro adalah menghindari kontaminasi yang dapat terjadi pada setiap saat dalam masa kultur . Kontaminasi umumnya disebabkan oleh sterilisasi media yang kurang sempurna, lingkungan kerja dan pelaksanaan atau cara kerja saat penanaman (kecerobohan pelaksana), eksplan, molekul-molekul atau benda-benda asing berukuran kecil yang jatuh atau masuk ke dalam botol kultur setelah penanaman dan ketika diletakkan di ruang kultur. Agar kontaminasi tidak terjadi maka faktor-faktor tersebut harus berada dalam kondisi aseptik. Kondisi aseptik dapat dicapai dengan metode sterilisasi. Secara umum, metode sterilisasi dikelompokkan dalam metode sterilisasi pemanasan kering menggunakan oven, metode sterilisasi pemanasan basah menggunakan autoklaf, metode ultrafiltrasi dengan menggunakan filter milipore (digunakan untuk hormone dan ZPT), metode sterilisasi dengan bahan kimia bisa menggunakan alkohol 70 % atau 80 %, metode sterilisasi laminar air flow cabinet menggunakan sinar UV

Dalam praktikum pembuatan media, sterilisasi yang dilakukan meliputi sterilisasi alat-alat penanaman dan media tanam.

  1. Sterilisasi alat-alat penanaman

Alat-alat tanam yang disterilisasi meliputi : Pinset, scapel, Petridish, Botol-botol kultur. Sterilisasi pada alat tanam dilakukan dengan sterilisasi fisik melalui pemanasan maupun sterilisasi mekanik dan kimawi. Sterilisasi mekanik dan kimiawi dilakukan dengan mencuci alat-alat menggunakan sabun yang mengandung bahan kimiawi.

  1. Sterilisasi media tanam

Sterilisasi media tanam dilakukan dengan sterilisasi fisik, yakni dengan pemanasan menggunakan autoklaf. Media tanam yang telah dimasukkan dalam botol kultur selanjutnya ditata pada rak autoklaf dan dimasukkan ke dalam tabung autoklaf. Pada prinsipnya, sterilisasi autoklaf menggunakan panas dan tekanan dari uap air. Temperature sterilasi biasanya 121o C, tekanan yang biasa digunakan antara 15-17,5 psi (pound per square inci) atau 1 atm selama 45 menit. selanjutnya setelah 45 menit media dikeluarkan dan ditata dalam rak kultur diruang steril.

Dalam proses sterilisasi memungkinkan dapat terjadi kegagalan sterilisasi seperti :

  • Ketidakberhasilan sterilisasi akibat adanya salah satu atau beberapa kunci pada autoklaf yang tidak menutup dengan sempurna sehingga tekanan yang timbul dari autoklaf bocor ke luar.
  • Kegagalan sterilisasi akibat sebelum tekanan dalam autoklaf menurun dan semua air yang ada di autoklaf belum habis autoklaf sudah terbuka sehingga dapat menimbulkan ledakan atau kerusakan klep pengatur tekanan pada autoklaf.

Kegagalan sterilisasi dapat dihindari dengan jalan mengikuti semua ketentuan dan prosedur pelaksanaan sterilisasi meliputi penggunaan alat dan pelaksanaan prosedur sterilisasi.

  1. Kesimpulan dan Saran
      1. Kesimpulan
        1. Media merupakan faktor utama yang menentukan keberhasilan dalam perbanyakan dengan kultur jaringan sehingga komposisi nutriennya harus benar-benar diperhatikan.
        2. Pembuatan media MS dilakukan adalah dengan mencampur unsur makro, unsur mikro, vitamin, gula, dan ZPT serta agar dengan cara dididihkan kemudian disterilisasi dan disimpan dalam inkubator. Media MS mengandung unsur hara makro, mikro, vitamin, dan ZPT.
        3. Alat dan media kultur jaringan yang akan digunakan harus disterilisasi agar tidak ada kontaminan yang mengganggu. Contoh sterilisasi adalah sterilisasi dengan autoklaf yang merupakan salah satu metode sterilisasi dengan uap air dibawah tekanan. Selain itu, alat kultur jaringan juga bisa disterilisasi dengan pemanasan langsung.
      2. Saran
        1. Pembuatan larutan stok media MS dilakukan secara hati-hati untuk menghindari terjadinya kesalahan penimbangan sebab bahan-bahan kimia untuk membuat media diperlukan dalam jumlah yang sedikit.
        2. Pada pembuatan media harus diperhatikan jenis eksplan yang akan dikulturkan sehingga dapat memilih dan menentukan media yang tepat yang akan digunakan.
        3. Pada tahap sterilisasi harus diperhatikan betul tahapan-tahapan dan prosedur sterilisasi agar dapat meminimalisir kegagalan sterilisasi.

Daftar Pustaka

Bernice, M. Martin.1994. Tissue Culture Technique. USA : Boston University

Endang Yuniastuti.2008. Buku Petunjuk Praktikum Kultur Jaringan. Surakarta : UNS Press

Herawan, T dan M. Na’iem. 2006. Pengaruh Jenis Media dan Konsentrasi Zat Pengatur Tumbuh Terhadap Perakaran pada Kultur Jaringan Cendana (Santalum album Linn.). Jurnal Agrosains 19(2) : 103-109

Kyte, Lydiane & John Kleyn. 1996. Plants from Test Tubes. USA: Timber Press

Marlina, N. 2004. Teknik Modifikasi Media Murashige dabn Skoog (MS) untuk Konservasi In Vitro Mawar (Rossa sp). Jurnal Buletin Teknik Pertanian 9(1): 4-6

Matatula, A.J. 2003. Subtitusi Media MS dengan Air Kelapa dan Gandasil-D pada Kultur Jaringan Krisan. Eugenia 9(4):203-2011

Nugroho, A dan Sudito. 2000. Teknik Kultur Jaringan. Penebar Swadaya: Jakarta Ritonga, A. W. 2007. Pembuatan Kultur Jaringan Tanaman. Bogor: Institut Pertanian Bogor

Purnamaningsih, R. 2006. Induksi Kalus dan Optimasi Regenerasi Empat Varietas Padi melalui Kultur In Vitro. Jurnal AgroBiogen 2(2): 74-80

Rahardja, P.C. 1995. Kultur Jaringan Teknik Perbanyakan Tanaman Secara Modern. Penebar Swadaya: Jakarta.

Wetherel, D.F. 2008. Propagasi Tanaman Secara In Vitro. Avery Publishing Group Inc. New Jersey.

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *